一种基于3D打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料及其制备方法

本发明人工耳廓制备领域，具体涉及一种基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料及其制备方法

背景技术：

1、人工耳廓是一种用于替代丧失或损伤耳廓结构的整形修复医疗器械。它采用生物相容性材料制造，能够高度仿生恢复耳部外观，提升患者的自信。然而，尽管在美观和功能恢复上取得了一些成效，但相关手术和植入的过程仍面临一系列问题，特别是感染风险和术后并发症。这些问题不仅给患者带来生理和心理上的压力，也增加了医护人员的工作负担。目前，针对这些问题尚未找到高效的解决方案。

2、随着组织工程和材料科学的进步，以软骨细胞为基础的人工耳廓逐渐从实验室走向临床应用。这种类型的人工耳廓通过组织工程技术，利用患者自身或捐赠的软骨细胞进行培养、扩增和成型，最终制成与自然耳廓在结构和功能上较为相似的替代品。这种方法不仅在外观上恢复了耳廓，还具有更好的生物相容性，降低了排异反应和术后感染的风险。此外，该类人工耳廓结合了生物材料和3d打印支架技术，在多种细胞因子的诱导下，形成更契合患者个体需求的耳廓支架，从而为软骨细胞的附着、生长与分化提供了优良的条件。

3、不过，由于人工耳廓的厚度，其周边组织的微弱血供不足以支持中间细胞的正常生理功能，导致缺氧性细胞凋亡，进而形成坏死核心。这种现象会加速人工耳廓细胞的凋亡和崩解，影响其长期在体内的存活。对此，目前常见的解决方案，是通过设计具有孔隙结构的水凝胶支架并打印，在支架中光固化负载有间充质干细胞的水凝胶。但是此类方法仍然具有许多缺点，例如人工耳廓具有复杂的力学结构和外形，需要在不同厚度结构中负载不同体积的水凝胶与间充质干细胞，因此需要在不同厚度和部位设计不同的孔径结构；此外为了保证人工耳廓植入体内后具有优良的营养与废物交换能力，需要在人工耳廓支架上设计具有取向性的孔径结构。而目前的光固化打印，在打印水凝胶支架上无法在微米尺度上满足这样的设计要求，并且打印形成的疏松支架并不能满足人工耳廓严苛的力学需求和细胞附着

4、基于上述问题，本发明创新的采用选择性冷冻和冻干的工程技术，先通过光固化打印人工耳廓支架的致密结构；随后将人工耳廓支架的对耳轮、耳垂结构紧密的贴合在冷台表面，此时由于人工耳廓漏斗形的特殊形态的其余部分和冷台有一定距离。将冷台降温至-60～-40℃，进行选择性冷冻，由于人工耳廓结构距离冷台距离不同，外部结构紧贴冷台，降温速率较快，会率先冻结形成较小的冰晶，而中央结构远离冷台，降温速率较慢，会形成较大的冰晶。并且由于温度是从外部传导至内部，形成的冰晶是连续且向心的结构，在冻干机中进行冻干时，会形成向心性的孔道结构。该类结构能够在人工耳廓的不同部位负载不同密度的间充质干细胞，在体外软骨分化后形成的人工耳廓软骨结构会更贴近于真实的耳廓的力学结构，此外，向心性的孔道为人工耳廓中软骨细胞的生长与分化带来诸多优势：1)中央部分细胞的营养与废物交换提供了更高的效率，为该类人工耳廓在体内的长期存活提供了生理学基础；2)滴涂方法负载的细胞，容易附着人工耳廓支架的表面，外侧小中心大的向心性促进了软骨细胞的向内生长、迁移与成骨分化。

5、此外，本发明通过对耳廓进行3d重建，提供了一种更加便捷的人工耳廓建模方法。这不仅极大地提升了医患之间的沟通效果，还能在设计阶段更好地满足患者在美学和功能上对耳部结构重建的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，以及结合各类材料和工艺的优点，提供一种基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料及其制备方法，以促进软骨细胞自外向内进行成软骨分化，为新型人工耳廓支架研发提供新思路。

2、本发明采用以下技术方案实现：

3、一种基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料的制备方法，包括如下步骤：

4、1)人工耳廓支架设计：使用激光雷达结合深度感知应用根据需要进行耳廓三维重建，得到3d模型文件，为带孔结构的耳廓模型；

5、2)打印预溶液的配置:分别配制出低浓度和高浓度的colma溶液并冷却，其中高浓度的colma溶液即无细胞的打印预溶液，然后将间充质干细胞(mscs)分散在低浓度的colma溶液中，得到载细胞滴涂预溶液；

6、3)人工耳廓支架打印与选择性冷冻：进行光固化打印得到人工耳廓凝胶支架；然后将人工耳廓凝胶支架浸泡于无菌pbs中，浸泡完成后进行选择性冷冻和冻干，得到人工耳廓支架即形成一级多孔支架基底层；

7、4)人工耳廓支架的成软骨分化：向载细胞滴涂预溶液中加入含促成软骨因子并使用滴涂法引入到步骤3)得到的人工耳廓支架上，待其孔结构吸附足量的载细胞滴涂预溶液后，进行光固化，随后在含促成软骨因子的培养基中培养，形成二级载细胞凝胶层；

8、5)人工耳廓支架的保护层制备：在步骤4)得到的人工耳廓支架表面循环浸渍-uv固化，形成三重高浓度colma凝胶保护层，制得基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料。

9、进一步的，步骤1)中，可以通过带有激光雷达的移动设备中使用深度感知应用对耳廓进行扫描重建，所述的3d建模方法包括泼溅法、高斯混合模型和表面网格细分法中的一种或多种。

10、进一步的，步骤2)中，打印预溶液的配置过程中，在无菌、避光及60-80℃条件下将colma冻干粉末溶于含有光引发剂的pbs溶液中，colma的取代度为60-90％，所述低浓度的colma溶液浓度为5-7.5wt％，所述高浓度的colma溶液浓度为10-20wt％；

11、所述冷却为冷却到37℃以下；

12、所述光引发剂为lap、irgacure、i2959中的一种或几种，浓度为0.1-0.25wt％；

13、所述的间充质干细胞在p2-p5代以内，浓度1×107个/ml。

14、进一步的，步骤3)中，所述的光固化打印过程中，将所述无细胞的打印预溶液装载至光固化打印机中，依照步骤1)得到的3d模型文件，采用螺旋花瓶打印模式，光源为350-410nm的uv光源，功率为20-40mw/cm2，喷嘴直径为100-400μm，打印层厚度为100-400μm，打印温度为35-37℃，湿度为60-80％；

15、所述浸泡时间为至少30min。

16、进一步的，步骤3)中，所述选择性冻冷冻过程中，人工耳廓凝胶支架的对耳轮、耳垂结构紧密的贴合在冷台表面，此时漏斗型人工耳廓其余部分与冷台无接触，冷台温度为-60～-40℃，冷冻时间为1-3h；

17、所述冻干的真空度小于0.1mbar。

18、进一步的，步骤4)中，所述载细胞滴涂预溶液和培养基中添加的成软骨因子为tgf-β(转化生长因子β)，bmps(骨形态发生蛋白)，igf-1(胰岛素样生长因子-1)和fgf-2(成纤维细胞生长因子-2)中的一种或多种，浓度分别为10-20ng/ml和5-10ng/ml；

19、所述培养基为低葡萄糖的dmem、α-mem中的一种或多种，培养时间为4到8周；

20、所述滴涂法的时间为30-50s；

21、所述光固化过程中，光源为350-410nm的uv光源，功率为20-40mw/cm2，固化时间为10-15s。

22、进一步的，步骤5)中，循环浸渍-uv固化工艺过程中，浸渍液为colma冻干粉末溶于含有0.1-0.25wt％lap的pbs溶液中，配置15-20wt％的colma溶液，浸渍时间10-30s，光固化时光源为350-410nm的uv光源，功率为20-40mw/cm2，固化时间为20-30s，循环次数为3-5次。

23、一种基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料，采用任一所述的方法制得。

24、相对于现有技术，本发明具有以下优点：

25、1)本发明使用简单的colma作为原材料，创新性的利用3d光固化打印，选择性冷冻、低温冻干、溶液滴涂、体外成软骨分化和循环浸渍包被等组合工艺，制备一种基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料，此类工艺组合，为本发明首创。

26、2)本基于3d打印-选择性冷冻技术的多功能复合人工耳廓支架材料，具有多功能复合结构，在满足人工耳廓基础的外观结构的同时，通过负载细胞提升了其生物相容性，并且通过选择性冷冻和冻干技术形成取向性孔径，增强了细胞的营养与废物交换能力。上述功能的深度整合，完善了人工耳廓的完整的生理结构，为其体内长期存活奠定了生理学基础。

27、3)利用激光雷达结合深度感知应用对人工耳廓进行3d建模，替代了传统的灌注倒模和基于ct的建模方法。与灌注倒模建模方法相比，这种3d建模方法提供了自定义人工耳廓形态的可能性；与ct建模方法相比，该方法极大地简化了建模成本和难度。患者和医生可以通过直接沟通，对人工耳廓在美学和功能上进行自定义调节。这种用于人工耳廓建模的方法是本发明的独创之处。

28、4)本发明结合3d打印、选择性冷冻和冻干技术，在凝胶人工耳廓支架中形成通常3d光固化打印机难以形成的孔径尺度，传统光固化打印形成的支架孔径结构受到打印喷嘴、打印台精度和材料溶胀系数的三重限制，在这类打印水凝胶材料中，很难形成微小的孔径，从而限制了间充质干细胞在其中的负载，并降低了最终成骨分化的硬度。而本发明采用冻干工艺形成致密的孔结构，能够以更高密度负载间充质干细胞，从而形成具有更高强度的人工耳廓。

29、5)本发明基于人工耳廓的形态结构特点和形态中的力学结构差异，创新性的改进选择性冷冻和冻干工艺。在选择性冷冻步骤中，人工耳廓支架的对耳轮、耳垂结构紧密的贴合在冷台表面，此时由于人工耳廓漏斗形的特殊形态的其余部分和冷台有一定距离。将冷台降温至-60℃～-40℃，进行选择性冷冻，由于人工耳廓结构距离冷台距离不同，外部结构紧贴冷台，降温速率较快，会率先冻结形成较小的冰晶，而中央结构远离冷台，降温速率较慢，会形成较大的冰晶。并且由于温度是从外部传导至内部，形成的冰晶是连续且向心的结构，在冻干机中进行冻干时，会形成向心性的孔道结构。该类结构能够在人工耳廓的不同部位负载不同密度的间充质干细胞，在体外软骨分化后形成的人工耳廓软骨结构会更贴近于真实的耳廓的力学结构，此外，向心性的孔道为人工耳廓中软骨细胞的生长与分化带来诸多优势：1)中央部分细胞的营养与废物交换提供了更高的效率，为该类人工耳廓在体内的长期存活提供了生理学基础；2)滴涂方法负载的细胞，容易附着人工耳廓支架的表面，外侧小中心大的向心性促进了软骨细胞的向内生长、迁移与成骨分化。上述优势所带来的软骨力学结构，呈现外部较为柔软，中央较为坚硬的分布，这样的分布更贴近于天然耳廓的力学结构，在天然耳廓中，外部的耳轮和耳垂相对柔软，起到外形支撑的作用，内部的耳甲，对耳轮和对耳屏比价坚硬，起到面部的连接和支撑作用。，这样的设计不仅从外观上满足了患者耳廓重建的需求，进一步从力学支撑，触感等方面全面模拟耳廓结构，极大的满足了患者的对耳廓修复的美观和真实感需求。

30、6)本发明在人工耳廓结构中创新性的使用三重结构，仿照真实耳廓“软骨-结缔组织-真皮层”结构，对人工耳廓凝胶支架使用冻干工艺并滴涂含促成软骨因子的载细胞滴涂预溶液，形成人工耳廓支架和二级载细胞凝胶层，这两层结构所形成的软骨和结缔组织，起到了主要外形维持和力学支撑作用；并用循环浸渍包被在表面形成高浓度colma凝胶保护层，用于进一步增强人工人工耳廓的强度。

31、7)本发明中的3d建模流程和基于选择性冷冻的的凝胶的成软骨技术适用于各类患者人工耳廓软骨重建和修补，技术具有极强的普适性。