基于丁酸偶联的多肽药物及其在抗肾小球基底膜病治疗中的应用

本发明属于生物医药，具体地，涉及基于丁酸偶联的多肽药物及其在抗肾小球基底膜病治疗中的应用。

背景技术：

1、肾小球肾炎是我国慢性肾脏病的重要病因之一，其中免疫炎症机制是其核心发病环节，针对病因开发疾病的免疫学治疗可延缓疾病进展，也是临床亟待开发的特异性治疗手段。在肾小球肾炎中，抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane,gbm)病是重要免疫性肾的经脏疾病的经典模型，也是预后最差的肾小球肾炎。抗gbm病为重症自身免疫性肾脏病，其发病的关键环节是肾小球基底膜(gbm)自身抗原α3(iv)nc1的暴露和抗gbm自身抗体的产生，抗原抗体结合后、介导免疫炎症反应，导致严重的肾脏损伤。

2、本技术发明人课题组前期历经10余年完善了该病的免疫发病机制，明确了致病性t细胞抗原表位α3-p14及其关键氨基酸，并利用该表位建立了抗gbm病大鼠模型，为开发免疫治疗奠定了基础。利用人类基底膜iv型胶原α1-5链的独特结构，本发明人课题组前期以非致病性α1-p14为模板，对α3-p14的关键氨基酸wixlwxgfxf进行替换，设计出改造肽m-p14。在抗gbm肾炎的动物模型中进行治疗，发现大鼠肾小球新月体显著减少或完全消失，治疗肽通过干预抗原递呈和调控t细胞分化发挥治疗作用。

3、但是经典的多肽结构对体内蛋白酶的稳定性较差，进入体内很快会被降解。此外，大多生物活性肽生物利用度比较差，无法口服，需要通过改变剂型进而研发获取适合的给药途径。基于以上这些因素，需要对活性肽进行结构修饰与化学改造。活性肽改造的目的多种多样，主要包括提高活性肽与受体的亲和力及选择性；增强多肽分子的药代稳定性，降低活性肽在体内的降解或者减少活性肽在体内的消除；提高活性肽的透膜能力；改善疏水肽的水溶性等。设计并合成得到一种有效的、经结构优化后的偶联多肽药物对最终实现治疗性多肽向临床试验的转化具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于为本领域提供一种基于丁酸偶联的多肽药物及其在抗肾小球基底膜病治疗中的应用，以解决现有技术中存在的上述技术问题。

2、本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

3、本发明的第一方面提供了一种基于丁酸偶联的偶联多肽。

4、进一步，所述偶联多肽以丁酸或2-氨基丁酸修饰多肽序列得到；

5、以丁酸修饰多肽序列得到的偶联多肽为：c4h8o2-(k)n-连接子-tdippcphgwsslwkgfsfimf；

6、以2-氨基丁酸修饰多肽序列得到的偶联多肽为：c4h9no2-(k)n-连接子-tdippcphgwsslwkgfsfimf。

7、进一步，所述连接子包括6-氨基己酸和/或β-丙氨酸。

8、进一步，所述连接子为6-氨基己酸。

9、进一步，所述n选自3-8之间的任意整数值。

10、进一步，所述n＝5。

11、在一些实施方案中，所述丁酸(butyric acid,ba)是一种直链饱和脂肪酸，分子量为88.11，化学式为c4h8o2，熔点为-7.9℃。常温常压下丁酸是一种腐臭的酸味油状液体，能与水、乙醇和乙醚混溶。在本发明的具体实施方案中，所述丁酸又称为ba。

12、在一些实施方案中，所述2-氨基丁酸(2-aminoisobutyric acid,2a)是分子量为103.1198的化学物质。无色单斜结晶。熔点335℃，280℃开始升华。易溶于水，难溶于醇，不溶于醚。其对应的化学式为c4h9no2。在本发明的具体实施方案中，所述2-氨基丁酸又称为2a。

13、在一些实施方案中，所述6-氨基己酸(6-aminohexanoic acd,ahx)，是一种含有六个碳原子的直链氨基酸类似物，具有一个氨基和一个羧基。它常被用作多肽合成中的连接子(linker)，用于连接不同的分子片段。在本发明的具体实施方案中，所述6-氨基己酸又称为ahx。

14、在一些实施方案中，与本发明如前所述的偶联多肽的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的偶联多肽同样落入本发明的保护范围内。

15、此外，本发明还提供了如前所述的偶联多肽对应的偶联多肽衍生物，所述偶联多肽衍生物包括在本发明如前所述的偶联多肽上进行修饰得到的偶联多肽衍生物、或在本发明如前所述的偶联多肽上连接缀合物得到的偶联多肽衍生物。

16、进一步，所述修饰包括疏水基团修饰、酯化修饰、酰胺化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、聚乙二醇化修饰、烷基化修饰、氨基化修饰、羰基化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、羟基化修饰、羧基化修饰、硫酸化修饰和/或环化修饰。

17、进一步，所述缀合物包括荧光染料、金属离子、放射性化合物、酶和/或细胞穿透肽。

18、在一些实施方案中，本发明所述偶联多肽衍生物可以是在本发明第一方面所述的偶联多肽的n末端进行疏水基团修饰得到的多肽衍生物。示例性地，所述疏水基团包括但不限于：棕榈酸、硬脂酸、油酸、肉豆蔻酸、亚油酸、胆固醇和花生四烯酸中的任意一种或多种的组合。

19、在一些实施方案中，本发明所述偶联多肽衍生物可以是将细胞穿透肽连接在本发明第一方面中所述的偶联多肽的n末端得到的多肽衍生物。细胞穿透肽又称为靶向多肽、蛋白质转导结构域、特洛伊木马肽等，其是一大类短氨基酸序列(5-30个残基)，能够穿过生物膜并传递多种化合物至细胞内，包括小分子、蛋白质、病毒、核酸、成像剂和药物等。本发明所述的细胞穿透肽包括任何本领域公知的细胞穿透肽。

20、在一些实施方案中，所述缀合物可以是检测试剂，所述检测试剂可以是具有可检测的物理或化学特性的任何物质，示例性地，检测试剂包括但不限于荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)，放射性标记(例如，125i、35s、14c、3h或32p等)，特别地，放射性标记(例如，55mn、162dy、157gd、52cr或56fe等)，金属离子(例如，111in、68ga、72as、97ru、67ga、89zr或201tl等)，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及elisa中常用的其他酶)，电子转移剂(例如，金属结合蛋白等)，发光和化学发光标记(例如，荧光素、2,3-二氢酞嗪或鲁米诺等)，磁珠，以及比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯或聚丙烯等)。

21、此外，本发明还提供了如前所述的偶联多肽对应的药学上可接受的盐，所述偶联多肽对应的药学上可接受的盐是指所述偶联多肽与无机和/或有机酸形成的酸式盐及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。优选为药用(即无毒的、生理学上可接受的)盐，但其它盐也是有用的。所述偶联多肽的可药用盐可例如通过以下方法形成：在介质中使所述偶联多肽与一定量的酸或碱反应，所述介质为例如盐在其中析出的介质或为含水介质(反应后冻干)。

22、具体的可药用盐包括在可靠的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应等，并且与合理的益处或危险比例相称的那些盐。药学上可接受的盐(可药用盐)在本领域是公知的。本发明所述偶联多肽的可药用盐包括衍生自合适的无机和有机酸和无机和有机碱的盐。

23、在一些实施方案中，制备所述偶联多肽的药学上可接受的盐的适合的酸包括但不限于：马来酸、酰化氨基酸、醋酸、2,2-二氯醋酸、月桂酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、硼酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1s)-樟脑-10-磺酸、丙二酸、甲磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘二磺酸、正己酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、环己基氨基磺酸、十二烷基硫酸、1-羟基-2-萘甲酸、草酸、棕榈酸、癸酸、1,2-乙二磺酸、乙磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、l-谷氨酸、α-酮戊二酸、甘醇酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、d-葡萄糖醛酸、马尿素、氢溴酸、盐酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、氢碘酸、(+)-l-乳酸、(-)-l-苹果酸、磷酸、l-焦谷氨酸、鞣酸、l-酒石酸、葡糖二酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、硫酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和/或戊酸。

24、在一些实施方案中，制备所述偶联多肽的药学上可接受的盐的适合的碱包括但不限于：无机碱，如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌和/或氢氧化钠；有机碱，如伯、仲、叔、丁、脂肪族和芳香族胺，包括：l-精氨酸、胆碱、二甲胺乙醇、二乙醇胺、苯乙苄胺、二甲胺、丙胺、二苄乙二胺、二乙胺、乙醇胺、乙胺、乙二胺、二异丙胺、二乙氨基乙醇、异丙胺、葡甲胺、海巴明、1h-咪唑、l-赖氨酸、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、仲胺、吗啡林、4-(2-羟乙基)吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟乙基)吡咯烷、三乙醇胺、三乙胺、n-甲基-d-葡萄糖胺、三甲胺、三羟甲基氨基甲烷和/或氨丁三醇。

25、本发明的第二方面提供了一种药物组合物。

26、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的偶联多肽。

27、在一些实施方案中，所述药物组合物包含治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的偶联多肽。

28、在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含第二治疗剂。

29、在一些实施方案中，所述第二治疗剂为其它能够用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物。

30、在一些实施方案中，所述其它能够用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物包括但不限于：醋酸氢化可的松、醋酸泼尼松、地塞米松、倍他米松、环磷酰胺、他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、甲泼尼龙、硫酸皮肤素、硫酸氨基葡萄糖、糖氨聚糖、硝苯地平、氨氯地平。

31、在本发明中，所述第二治疗剂并无特别限制，任何能够用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病、或辅助治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物均属于第二治疗剂的范畴。在本发明已经通过实验明确证明了所述偶联多肽具有治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的作用的情况下，本领域技术人员可根据实际需要将所述偶联多肽与其他药物联合用于抗肾小球基底膜病的治疗和/或预防中，因此，将本发明第一方面所述的偶联多肽作为唯一活性成分或将本发明第一方面所述的偶联多肽和上述第二治疗剂中的任意一种或多种联合作为活性成分用于抗肾小球基底膜病的治疗和/或预防中均落入本发明的保护范围内。

32、本发明的第三方面提供了一种药物制剂。

33、进一步，所述药物制剂包含本发明第一方面所述的偶联多肽。

34、进一步，所述药物制剂包含药学上可接受的载体和/或赋形剂；

35、可选地，所述药物制剂的剂型包括注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、气雾剂、肠溶衣、微乳剂或复合型乳剂。

36、在一些实施方案中，所述药物制剂可根据本领域已知的任何制备方法制备获得。用于此目的时，如果需要，可将所述偶联多肽与一种或多种固体或液体辅料结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

37、在一些实施方案中，所述药物制剂的剂型包括经肠胃道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。

38、在一些实施方案中，所述经肠胃道给药剂型包括溶液剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、散剂、缓释剂、泡腾剂、乳剂、糖浆剂、滴剂和/或咀嚼剂。

39、在一些实施方案中，所述非经胃肠道给药剂型包括注射给药剂型、呼吸道给药剂型、腔道给药剂型、粘膜给药剂型和/或皮肤给药剂型。

40、在本发明中，所述药物制剂的剂型并无特别限制，在一些实施方案中，可以将本发明如前所述的药物组合物制备成注射剂或口服制剂的药物制剂，包括但不限于：口服液体制剂、颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释剂、栓剂、气雾剂、纳米制剂、酊剂、糖浆剂、酒剂、露剂。本领域技术人员可根据实际需求(例如提高药物的生物利用度、提高患者的服药依从性等)选择本领域公知的合适的剂型。

41、在一些实施方案中，本发明提供的偶联多肽、包含所述偶联多肽的药物组合物或包含所述偶联多肽的药物制剂可以单位剂量形式给药，给药途径包括但不限于：肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、胶囊、滴丸、气雾剂、混悬剂、乳剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

42、在一些实施方案中，为了将包含偶联多肽的单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种辅料。关于辅料的实例包括但不限于：稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、碳酸钙、微晶纤维素等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、十二烷基磺酸钠等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

43、在一些实施方案中，为了将包含偶联多肽的单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种辅料。关于辅料的例子包括但不限于：稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

44、在一些实施方案中，为了将包含偶联多肽的单位给药剂型制成胶囊，将有效成分(偶联多肽)与上述各种辅料混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分(偶联多肽)制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

45、在一些实施方案中，为了将包含偶联多肽的单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂包括但不限于：水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。

46、在某些实施方案中，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

47、在本发明中，所述药物、药物组合物或药物制剂的有效治疗和/或预防剂量可以根据实际制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。只要其能够对所述疾病或相关症状产生预期的治疗和/或预防效果，这样的给药剂量均落入本发明的保护范围内。

48、本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的偶联多肽的制备方法。

49、进一步，所述方法包括采用丁酸或2-氨基丁酸修饰多肽序列tdippcphgwsslwkgfsfimf制备得到本发明第一方面所述的偶联多肽。

50、此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的偶联多肽，本发明第二方面所述的药物组合物和/或本发明第三方面所述的药物制剂。

51、在一些实施方案中，所述受试者包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类如黑猩猩及其它猿类和猴类；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本发明的一个实施方案中，所述受试者为人。术语受试者包括确诊患者。

52、在一些实施方案中，所述施用的途径包括但不限于：经口、局部、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、皮内、鼻内、肺内、直肠内等。在具体实施方案中，可由临床医师根据受试者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对受试者有益的剂量进行施用。

53、在一些实施方案中，所述有效量是指有效产生理想预防、缓解或治疗效果的药物、药物组合物或药物制剂的量。根据活性成分(在本发明中，尤指本发明如前所述的偶联多肽或其药学上可接受的盐、药物组合物或药物制剂)、症状及其严重程度、被治疗哺乳动物的年龄等因素的不同，达到有效量的本发明所述的药物、药物组合物或药物制剂的量也会随之变化，但可由本领域普通技术人员根据其所掌握的本领域的知识结合本发明公开的内容惯常地确定具体用量，能够产生上述效果的剂量均在本发明的保护范围内。

54、本发明的第五方面提供了如下任一方面应用：

55、(1)本发明第一方面所述的偶联多肽在制备用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物中的应用；

56、(2)本发明第一方面所述的偶联多肽在制备用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物组合物中的应用；

57、(3)本发明第一方面所述的偶联多肽在制备用于治疗和/或预防抗肾小球基底膜病的药物制剂中的应用。

58、在本发明中，所述治疗和/或预防是指推迟疾病发展、防止疾病发展和/或降低将会发展或预期会发展的所述症状的严重性。因此，这些术语包括改善已有的疾病症状、预防另外的症状、改善或预防症状的潜在的代谢原因、抑制障碍或疾病，例如，阻止障碍或疾病的发展、减轻障碍或疾病、使障碍或疾病退行、减轻由疾病或障碍导致的病症，或使疾病或障碍的症状停止。在本发明的一个具体实施方案中，所述疾病为抗肾小球基底膜病。

59、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

60、本发明首次公开了一种用于抗肾小球基底膜病治疗的基于丁酸偶联的多肽药物(m-p14-2a(2-氨基丁酸)、m-p14-ba(丁酸))，并通过对比实验证明了并非任意短链脂肪酸和小分子多肽m-p14偶联后对抗肾小球基底膜病均具有治疗效果，而本发明提供的基于丁酸偶联的多肽药物(m-p14-2a、m-p14-ba)能够显著减轻抗肾小球基底膜病模型中的肾脏损伤，并且其治疗效果显著优于m-p14，即本发明提供的基于丁酸偶联的多肽药物(m-p14-2a、m-p14-ba)在治疗抗肾小球基底膜病方面取得了预料不到的技术效果，为抗肾小球基底膜病治疗这一技术领域提供了一种全新的治疗策略，并为最终实现治疗性多肽向临床试验的转化奠定了基础，临床应用前景广阔。