一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法

本发明涉及雷公藤甲素诱导的肝毒性缓解，尤其涉及一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法。

背景技术：

1、雷公藤甲素(tp)是存在于卫矛科植物tripterygium wilfordii hook f根、叶、花、果实中的环氧二萜内酯类化合物，具有较强的抗癌和抗炎活性。雷公藤甲素可通过抑制tnf-α(肿瘤坏死因子-α，一种促炎细胞因子),il-6(白细胞介素-6，一种促炎细胞因子),cox2和il-18等细胞因子的表达同时抑制nf-κb、nlrp3、hmgb1、atf6/chop、rank/rank/opg，和nrf2信号通路等多种方法减少细胞黏附和凋亡起到抗炎症作用，但其具体机理仍然未知。尽管雷公藤甲素有较强的抗炎和抗癌活性，但是其结构上的众多环氧桥决定了其必然有较强的毒性。

2、然而，鉴于雷公藤甲素引发的各种器官毒性，包括肝脏、肾脏、卵巢和心脏在内的各种器官的潜在毒性，特别是肝毒性，其临床应用受到了很大限制。研究发现，tp诱导的肝毒性与氧化应激(ros)有关，ros是由氧化和抗氧化剂之间的不平衡引起的。ros导致脂质和dna损伤，导致细胞器功能障碍和损伤。大量体内和体外研究发现，tp可导致ros和丙二醛(mda)增加，超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽转移酶(gst)和gsh(还原型谷胱甘肽，细胞内重要的调节代谢物和抗氧化剂)减少。

3、麦角硫因(egt)是一种天然的组氨酸衍生化合物，具有较强的抗氧化活性。大量研究证实，天然抗氧化剂对预防氧化应激引起的肝脏疾病具有积极作用这是由于它们具有清除自由基的能力，并增强细胞内抗氧化酶的活性。麦角硫因(egt)作为一种抗氧化剂，可以有效地消除羟基自由基，与亚铁和铜离子螯合，抑制过氧化氢产生羟基自由基，激活细胞的自然抗氧化防御机制，能够减轻由氧化应激引起的肝脏损伤。在生理ph值下，麦角硫因(egt)是稳定的，因为它主要以硫酮的形式存在，使其能够抵抗自氧化。麦角硫因(egt)可以清除活性氧和活性氮等物质，从而降低氧化应激。

4、现有技术中用于配伍雷公藤甲素使用降低其毒性的药物有藏红花素、刺山柑或刺山柑提取物，但这些药物获取方法主要为植物提取，都为混合物，组成成分不明确，且药效及毒理作用尚未完全明确，与雷公藤甲素联用可能会导致其他症状，反而不利于雷公藤甲素的临床应用。

5、为此，设计一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法，为解决上述技术问题提供另一种技术方案。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题为：提供一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法，以解决其余药物缓解雷公藤甲素成本高、安全性低、效果不显著的问题。

2、为了解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案：

3、一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法，步骤如下：

4、s1：雷公藤甲素和麦角硫因联合处理硫酸葡聚糖钠盐诱导建立的炎症动物模型；根据疾病活动指数评分、结肠长度、结肠组织病理学染色、结肠组织硫氧还蛋白还原酶活性、谷胱甘肽水平、结肠组织硫氧还蛋白体系蛋白水平以及炎症因子表达水平的指标判断麦角硫因对雷公藤甲素药效的影响；

5、s2：根据肝脏系数、血清谷草氨酸/谷丙氨酸水平、肝脏组织病理学染色的急性毒性指标判断麦角硫因降低雷公藤甲素诱导肝毒性的效果。

6、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，建立炎症动物模型，步骤如下：

7、用含3％dss的饮用水喂养小鼠，持续7天，同时将雷公藤甲素和麦角硫因药物通过腹腔注射的方式给小鼠送药；第8天将小鼠的饮用水换为无菌水，并在禁食处理后得到炎症动物模型，对小鼠疾病活动指数、结肠长度、结肠组织病理学进行分析。

8、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，对结肠组织进行提取，步骤如下：

9、取结肠组织，放于离心管中；

10、加入缓冲液pbs和酶抑制剂pmsf，并进行匀浆；

11、对匀浆后的样品进行离心，取上清液。

12、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，对蛋白浓度测定，步骤如下：

13、蛋白溶液经pbs稀释，每孔取样加入酶标板中，随后每孔加入bca工作液，孵育后，检测吸光度，并根据标准曲线计算样品蛋白浓度。

14、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，对结肠组织trxr活性、gsh水平检测，步骤如下：

15、a.进行trxr活性检测，步骤如下：

16、将蛋白浓度测定后，将pbs缓冲液将样品稀释至同一浓度；

17、在酶标板中加入蛋白和nadph；

18、室温孵育后，特异性抑制对照孔中trxr活性；

19、然后加入nadph和dtnb的混合液，检测5min内每隔1min的吸光度变化；

20、b.进行gsh水平检测，步骤如下：

21、酶标板中加入蛋白，并将每个蛋白样品设置3个重复孔及一个对照孔；

22、在重复孔的内部添加nadph和gr，在对照孔的内部添加nadph；

23、室温孵育2min后，加入nadph和dtnb的混合液，检测5min内吸光度变化，样品gsh水平等于样品孔斜率减去对照孔斜率。

24、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，对结肠组织trx体系蛋白水平检测，步骤如下：

25、将蛋白浓度测定后，将处理后的样品，进行稀释；

26、置于100℃金属浴中进行反应，持续时间为10分钟；

27、反应完成后，让样品自然冷却并保存；

28、采用western blot技术检测trx体系相关抗氧化酶的蛋白水平。

29、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，对结肠组织炎症因子水平检测，步骤如下：

30、依据trizol法的标准操作流程，对结肠组织样本进行总rna的提取，提取得到的rna，采用两步法将其反转录为cdna，利用实时荧光定量pcr技术对炎症因子il-1β、il-6和tnf-α的表达水平进行检测。

31、作为本发明提供的所述的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法的一种优选实施方式，所述s2步骤中，对肝脏的急性毒性检测步骤如下：

32、动物模型建立：用含3％dss的饮用水喂养小鼠，持续7天，同时将tp和egt药物通过腹腔注射的方式给小鼠送药；第8天断食12h后，眼球取血并提取小鼠肝组织；

33、肝脏毒性分析：将完整切除后的肝脏，在清理后，称取肝脏重量，并计算肝脏系数；

34、将提取的血液室温静置，待上下分层后，于离心力为2500g、温度为4℃下离心15min，然后收集上清液，将上清液用生理盐水稀释20倍后，使用全自动生化分析仪检测血清中的ast、alt水平，小鼠肝组织经4％多聚甲醛固定后，用于he染色观察细胞具体形态结构和病理损伤。

35、本发明还公开了一种药物组合物，包括麦角硫因和雷公藤甲素，麦角硫因和雷公藤甲素的质量比为1-20∶1。

36、作为本发明提供的所述的一种药物组合物的一种优选实施方式，药物组合物在制备缓解炎症疾病的药物中的应用。

37、同时，通过以上技术方案，本发明至少具备以下有益效果：

38、(1)本发明提供的一种基于麦角硫因的降低雷公藤甲素诱导肝毒性的方法，通过采用麦角硫因与雷公藤甲素的配合使用，进而能够增加麦角硫因的用途，同时缓解具体疾病模型下雷公藤甲素诱导的急性肝损伤，且不影响其药效；从而为雷公藤甲素辅助用药提供新思路，减少临床用药副作用；

39、(2)在使用时，不仅拓宽了egt的应用范围，同时在不影响tp药效的情况下，缓解了疾病状态下tp诱导的急性肝损伤，为tp的临床辅助用药提供了新思路，开拓了拮抗雷公藤甲素肝毒性药物的应用前景；

40、(3)提供现有常用且研究透彻、成本较低的临床药物麦角硫因，保证其用药安全性，降低导致其他症状的风险。