经改善的嵌合受体的制作方法

本发明总体上涉及包含细胞外结构域的嵌合受体，该细胞外结构域包含突变的fc结构域。本发明还涉及表达本发明的嵌合受体的经转导的免疫细胞和/或编码本发明的嵌合受体的核酸分子。本发明进一步提供了药盒，该药盒包含：此类细胞和/或编码嵌合受体的核酸分子；以及能够与嵌合受体结合的抗体。

背景技术：

1、过继性t细胞疗法(act)是一种使用癌症特异性t细胞的强大治疗方法(rosenberg和restifo,science 348(6230)2015:62-68)。act可以使用天然存在的肿瘤特异性细胞或通过使用t细胞或嵌合抗原受体的基因工程使肿瘤具有特异性的t细胞(rosenberg和restifo,science 348(6230)2015:62-68)。act可以成功治疗和诱导缓解甚至患有晚期和其他治疗难治性疾病的患者，诸如急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤(dudley等人，j clin oncol 26(32)2008:5233-5239；grupp等人，n engl j med 368(16)2013:1509-1518；kochenderfer等人，j clin oncol.33(6)2015:540-549)。

2、然而，尽管临床疗效令人印象深刻，但act受到治疗相关毒性的限制。act中使用的工程化t细胞的特异性以及由此产生的靶向和脱靶效应主要由抗原结合受体中实施的肿瘤靶向抗原结合部分驱动(hinrichs等人，nat biotechnol.31(11)2013,999-1008)。由于不可耐受的治疗毒性，肿瘤抗原的非排他性表达或表达水平的时间差异可导致严重的副作用或者甚至是act的失败。实际上，除了少数谱系特异性抗原(诸如cd19、cd20或bcma)外，传统car-t细胞进展缓慢，特别是在实体瘤中，其中上皮肿瘤抗原被靶向，而这些抗原频繁在正常组织中表达，导致在靶脱肿瘤毒性(on-target off—tumor toxicities)，针对例如靶向her2的car-t细胞已证实此点(morgan等人，mol ther 18(4)1020:843-851)。因此，使car-t细胞更具肿瘤特异性的方法具有巨大的治疗潜力。

3、此外，用于有效裂解肿瘤细胞的肿瘤特异性t细胞的可用性取决于工程化t细胞在体内的长期存活和增殖能力。另一方面，由于不受控制的t细胞应答的持续存在会导致健康组织受损，所以t细胞的体内存活和增殖也可能导致不必要的长期影响(grupp等人，2013nengl j med368(16):1509-18，maude等人2014 2014n engl j med 371(16):1507-17)。

4、限制严重的治疗相关毒性和提高act安全性的一种方法是通过引入控制免疫突触形成的衔接子分子来限制t细胞的活化和增殖。此类衔接子分子包含小分子双模块开关，例如最近描述的叶酸-fitc开关(kim等人，j am chem soc 2015；137:2832-2835)。另一种方法包括人工修饰的抗体，所述抗体包含一个标签，用于指导和引导t细胞特异性靶向肿瘤细胞(ma等人，pnas2016；113(4):e450-458，cao等人angew chem 2016；128:1-6，rogers等人pnas2016；113(4):e459-468，tamada等人clin cancer res 2012；18(23):6436-6445)。

5、然而，现有的方法有几个局限性。依赖于分子开关的免疫突触需要引入额外的元件，这些元件可能会引发免疫应答或导致非特异性脱靶效应。另一方面，在现有治疗性单克隆抗体中引入标签结构可能会影响这些构建体的功效和安全性。此外，添加标签需要额外的修饰和纯化步骤，使此类抗体的生产更加复杂，并进一步需要额外的安全测试。

6、现有方法的另一个局限性是产生在靶脱肿瘤效应的可能性。在大多数适应证中，干净的靶标缺失，因为目标抗原(尽管在肿瘤细胞上高度表达)也在健康组织上表达。为了减少副作用并增加可药物治疗的靶抗原选择，仅具有局部活性的癌症特异性t细胞有利于此。为了改善car t细胞仅在肿瘤中活化的选择性，已经开发了不同的方法，例如氧敏感car(juillerat a等人，sci rep.2017；7:39833.于2017年1月20日发表，doi:10.1038/srep39833)。还已开发具有蛋白酶敏感接头的直接car，旨在改善传统act的安全性(han x等人，mol ther.2017；25(1):274-284.doi:10.1016/j.ymthe.2016.10.011)。然而，肿瘤活化的car很复杂，并且通常依赖于肿瘤内在的活化触发因素，诸如肿瘤相关蛋白酶。由于癌症的异质性质，这些活化触发因素的存在在不同的肿瘤病变、癌症类型和患者之间可能存在很大差异。

7、衔接子分子(在其他方面是生物惰性的，但与经工程化的嵌合受体进行特异性相互作用)可以允许以剂量依赖性方式控制t细胞活化。因此，此类衔接子方法提供了用以控制治疗相关副作用的替代性通用策略。然而，经工程化的正交配体/受体系统通常基于突变的配体受体界面，当被施用于患者时，该界面承担免疫原性的风险。这可能导致抗药物抗体的形成，其可潜在地导致细胞疗法的治疗活性组分暴露的损失。

8、因此，需要改善疗法来应对act的挑战。

技术实现思路

1、本发明提供了具有如下文所述的经改善的特性的嵌合受体。

2、本文提供了一种嵌合受体，其包括

3、(i)细胞外结构域，其包含突变的fc结构域或其片段，以及

4、(ii)跨膜结构域。

5、在一个实施例中，嵌合受体进一步包含(iii)至少一个细胞内刺激信号传导结构域和/或至少一个共刺激信号传导结构域。

6、在一个实施例中，细胞外结构域包含突变的ch2结构域和/或突变的ch3结构域。

7、在一个实施例中，细胞外结构域包含突变的ch2结构域和/或突变的ch3结构域，其中突变的ch2结构域和/或突变的ch3结构域包含氨基酸取代(根据kabat eu索引编号)：

8、(a)i253a、h310a和h435a；

9、(b)i253a；

10、(c)i253a和h310a；

11、(d)i253a和h435a；

12、(e)h310a和h435a；

13、(f)h310a；

14、(g)h435a；

15、(h)l234a、l235a和p329g；或(i)l234a、l235a、i253a、h310a、p329g和h435a。

16、在一个实施例中，跨膜结构域选自由以下项组成的组：cd8、cd4、cd3z、fcgr3a、nkg2d、cd27、cd28、cd137、ox40、icos、dap10或dap12跨膜结构域或其片段。

17、在一个实施例中，刺激信号传导结构域选自由以下项组成的组：cd3z的细胞内结构域、fcgr3a的细胞内结构域和nkg2d的细胞内结构域，或其片段，其保留刺激信号传导活性。

18、在一个实施例中，共刺激信号传导结构域选自由以下项组成的组：cd27的细胞内结构域、cd28的细胞内结构域、cd137的细胞内结构域、ox40的细胞内结构域、icos的细胞内结构域、dap10的细胞内结构域和dap12的细胞内结构域，或其片段，其保留共刺激信号传导活性。

19、在一个实施例中，共刺激信号传导结构域为：cd28细胞内结构域，或其片段，其保留cd28共刺激活性。

20、在一个实施例中，嵌合受体包含一个刺激信号传导结构域，该刺激信号传导结构域包括：cd3z的细胞内结构域，或其片段，其保留cd3z刺激信号传导活性，并且其中嵌合受体包含一个共刺激信号传导结构域，该共刺激信号传导结构域包括：cd137的细胞内结构域，或其片段，其保留cd137共刺激信号传导活性。

21、在一个实施例中，刺激信号传导结构域包含seq id no:13的氨基酸序列，并且共刺激信号传导结构域包含seq id no:12的氨基酸序列。

22、在一个实施例中，嵌合受体包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:87、seq id no:106、seq id no:125和seq id no:127。

23、在一个实施例中，提供了一种嵌合受体，该嵌合受体包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：seq id no:87、seq id no:106、seq id no:125和seq id no:127。

24、在一个实施例中，提供了一种经分离的多核苷酸，其编码如前文所述的嵌合受体。

25、在一个实施例中，提供了一种由如前文所述的经分离的多核苷酸编码的多肽。

26、在一个实施例中，提供了一种载体，特别是表达载体，其包含如前文所述的多核苷酸。

27、在一个实施例中，提供了一种经转导的t细胞，其包含如前文所述的多核苷酸或如前文所述的载体。

28、在一个实施例中，提供了一种能够表达如前文所述的嵌合受体的经转导的t细胞。

29、在一个实施例中，提供了一种试剂盒，其包含(a)经转导的t细胞，其能够表达如前文所述的嵌合受体，其中嵌合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含突变的fc结构域或其片段；以及(b)抗体，其包含能够与所述突变的fc结构域结合、但不能够与非突变的亲代fc结构域结合的至少一个抗原结合部分，其中抗体包含至少一个效应物部分。

30、在一个实施例中，提供了一种试剂盒，其包含(a)经分离的多核苷酸，其编码如前文所述的嵌合受体，其中嵌合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含突变的fc结构域或其片段；以及(b)抗体，其包含能够与所述突变的fc结构域结合、但不能够与非突变的亲代fc结构域结合的至少一个抗原结合部分，其中抗体包含至少一个效应物部分。在一个实施例中，所述效应物部分为：(i)抗原结合部分，其能够与靶细胞抗原结合；或(ii)以及免疫活化部分，特别是细胞因子。

31、在一个实施例中，提供了如前文所述的药盒，其用作药物。

32、在一个实施例中，提供了如前文所述的嵌合受体或如前文所述的经转导的t细胞，该嵌合受体或该经转导的t细胞用作药物，其中嵌合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含突变的fc结构域或其片段，其中在施用抗体之前、同时或之后施用表达嵌合受体的经转导的t细胞，该抗体包含：能够与靶细胞抗原结合的至少一个抗原结合部分；以及能够与突变的fc结构域结合、但不能够与非突变的亲代fc结构域结合的至少一个抗原结合部分。

33、在一个实施例中，提供了如前文所述的药盒，其用于疾病的治疗中，特别是用于癌症的治疗中。

34、在一个实施例中，提供了一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括：向受试者施用经转导的t细胞，该经转导的t细胞能够表达如前文所述的嵌合受体，其中嵌合受体包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含突变的fc结构域或其片段；以及在施用经转导的t细胞之前、同时或之后施用治疗有效量的抗体，该抗体包含能够与突变的fc结构域结合、但不能够与非突变的亲代fc结构域结合的至少一个抗原结合部分，其中抗体包含至少一个效应物部分。在一个实施例中，所述效应物部分为：(i)抗原结合部分，其能够与靶细胞抗原结合；或(ii)以及免疫活化部分，特别是细胞因子。

35、在一个实施例中，提供了如前文所述的嵌合受体、如前文所述的多核苷酸或如前文所述的经转导的t细胞用于制造药物的用途。

36、在一个实施例中，所述药物用于癌症的治疗。在一个实施例中，所述癌症选自上皮、内皮或间皮起源的癌症和血液癌症。