抗间皮素抗体及其用途的制作方法

发明领域本发明涉及包含抗间皮素抗原结合域的单克隆抗间皮素抗体和嵌合抗原受体(cars)、编码该抗体和cars的核酸和表达载体、包含该载体的重组细胞以及组合物，该组合物包含上述抗体、cars和包含该cars的宿主细胞。本发明还提供了制备所述抗体和cars的方法，以及使用所述抗体和cars治疗疾病的方法，所述疾病包括癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病和/或相关并发症。电子提交的序列表的引用本技术包含以电子方式提交的序列表。该电子序列表(065799.37wo1序列表.xml，大小：69,020字节，创建日期为2023年2月22日)在此通过引用完整地并入本文。

背景技术：

0、发明背景

1、间皮素(msln)是一种40kda的糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定糖蛋白，其正常表达严格限制在间皮细胞表面。msln的生理功能仍然难以捉摸，因为敲除间皮素基因的小鼠没有表现出显著的表型，这表明该蛋白对于任何重要功能来说是可有可无的(bera,t.k.等人，mol.cell.biol，2000,20:2902-2906)。另一方面，间皮素在许多癌细胞中过度表达，包括间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌(n.g.，am jsurg pathol，2003,27:1418-28)。间皮素的过度表达与疾病的不良预后有关。机制上，msln与ca125/muc16的相互作用与肿瘤的侵袭和转移有关(rump,a.等人，jbiol chem.2004,279:9190-9198；chen,s.h.等人,科学报道.2013,3:1870)。因此，选择合适的msln单克隆抗体可以靶向肿瘤细胞进行免疫细胞杀伤，同时降低肿瘤的侵袭性。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一个总体方面，本发明涉及特异性结合间皮素的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

2、提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3的重链可变区，以及包含轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3的轻链可变区，其分别具有以下多肽序列:

3、(1)seq id no：3、4、5、6、7和8，或者，seq id no：9、10、11、12、13和14；

4、(2)seq id no：17、18、19、20、21和22，或者，seq id no：23、24、25、26、27和28；

5、(3)seq id no：31、32、33、34、35和36，或者，seq id no：37、38、39、40、41和42；

6、(4)seq id no：60、61、62、63、64和65，或者，seq id no：66、67、68、69、70和71；

7、其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合间皮素，优选人间皮素。

8、在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，其多肽序列与seq id no:1、15、29或58有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，或包括轻链可变区，其多肽序列与seq id no:2、16、30或59有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

9、在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括:

10、(a)具有seq id no:1多肽序列的重链可变区和具有seq id no:2多肽序列的轻链可变区；

11、(b)具有seq id no:15多肽序列的重链可变区和具有seq id no:16多肽序列的轻链可变区；

12、(c)具有seq id no:29多肽序列的重链可变区和具有seq id no:30多肽序列的轻链可变区；或

13、(d)具有seq id no:58多肽序列的重链可变区和具有seq id no:59多肽序列的轻链可变区。

14、在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与间皮素结合，并能够通过抗体依赖的细胞毒性(adcc)、抗体依赖的细胞吞噬(adcp)和/或补体依赖的细胞毒性(cdc)诱导效应因子介导的肿瘤细胞裂解；和/或介导偶联药物的招募；和/或与具有癌症杀伤作用的另一单克隆抗体或其抗原结合片段形成双特异性抗体。

15、在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

16、在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段为人源或人源化的。在某些实施方式中，所述人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，其具有与seq id nos:43-46、52-55、72-75中的任意一个有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列；或轻链可变区，其具有与seq id nos:47-51、56-57、76-78中的任意一个有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

17、在某些实施方式中，人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包括:

18、(1)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

19、(2)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

20、(3)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

21、(4)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

22、(5)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

23、(6)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

24、(7)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

25、(8)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

26、(9)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

27、(10)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

28、(11)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

29、(12)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

30、(13)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

31、(14)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

32、(15)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

33、(16)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

34、(17)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

35、(18)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

36、(19)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

37、(20)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

38、(21)具有seq id no:52多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

39、(22)具有seq id no:52多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

40、(23)具有seq id no:53多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

41、(24)具有seq id no:53多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

42、(25)具有seq id no:54多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

43、(26)具有seq id no:54多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

44、(27)具有seq id no:55多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

45、(28)具有seq id no:55多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

46、(29)具有seq id no:72的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76的多肽序列的轻链可变区；

47、(30)具有seq id no:72的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77的多肽序列的轻链可变区；

48、(31)具有seq id no:72多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

49、(32)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

50、(33)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；

51、(34)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

52、(35)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

53、(36)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；

54、(37)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

55、(38)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

56、(39)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；或

57、(40)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区。

58、还提供了编码本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的分离核酸。

59、还提供了包含编码本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸的载体。

60、本发明还提供了包含载体的宿主细胞，其中，所述载体包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸。

61、在某些实施方式中，提供了药物组合物，所述药物组合物包括本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段或分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

62、本发明还提供了在有需要的受试者中特异性靶向癌细胞表面的间皮素的方法，所述方法包括将本发明的药物组合物施用于所述受试者。

63、本发明还提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括将本发明的药物组合物施用于所述受试者。癌症可以是任何液体或实体癌症，例如，其可以选自但不限于肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管细胞型肝癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、间皮瘤和其他实体肿瘤；以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。

64、本发明还提供了在有需要的受试者中治疗炎症和/或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括将本发明的药物组合物施用于所述受试者。

65、本发明还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在制备所述单克隆抗体或其抗原结合片段或所述双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下，培养包含编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段或所述双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，并从所述细胞或培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段或所述双特异性抗体或其抗原结合片段。

66、本发明还提供了制备本发明的包含单克隆抗体或其抗原结合片段或所述双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段或所述双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。

67、本发明还提供了检测受试者体内间皮素水平的方法。所述方法包括(a)从受试者获得样品；(b)用本发明的抗体或抗原结合片段接触样品；(c)测定受试者体内间皮素的水平。在某些实施方式中，所述样品是组织样品。例如，组织样品可以是癌症组织样品。在某些实施方式中，所述样品是血液样品。

68、在另一个总体方面，本发明涉及诱导t细胞介导的癌症杀伤的嵌合抗原受体(car)构建体，其中所述car构建体包括至少特异性结合人间皮素的抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号传导域。

69、本发明提供了包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列的分离的多核苷酸。所述car可包括：(a)包含至少一个特异性结合间皮素的抗原结合结构域的细胞外结构域；(b)铰链区；(c)跨膜区；(d)胞内信号转导域。

70、在某些实施方式中，所述抗原结合域包括包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3的重链可变区，以及包含轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3的轻链可变区，其分别具有以下多肽序列：

71、(1)seq id no：3、4、5、6、7和8，或者，seq id no：9、10、11、12、13和14；

72、(2)seq id no：17、18、19、20、21和22，或者，seq id no：23、24、25、26、27和28；

73、(3)seq id no：31、32、33、34、35和36，或者，seq id no：37、38、39、40、41和42；

74、(4)seq id no：60、61、62、63、64和65，或者，seq id no：66、67、68、69、70和71；

75、其中，所述抗原结合域特异性结合间皮素，优选人间皮素。

76、在某些实施方式中，所述抗原结合域包括重链可变区，其具有与seq id no:1、15、29或58有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列；或包括轻链可变区，其具有与seq id no:2、16、30或59有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

77、在某些实施方式中，所述抗原结合域包括：

78、(a)具有seq id no:1多肽序列的重链可变区和具有seq id no:2多肽序列的轻链可变区；

79、(b)具有seq id no:15多肽序列的重链可变区和具有seq id no:16多肽序列的轻链可变区；

80、(c)具有seq id no:29多肽序列的重链可变区和具有seq id no:30多肽序列的轻链可变区；或

81、(d)具有seq id no:58多肽序列的重链可变区和具有seq id no:59多肽序列的轻链可变区。

82、在某些实施方式中，所述抗原结合域为人源化的，并且包括重链可变区，其具有与seq id nos：43-46、52-55、或72-75有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列，或轻链可变区，其具有与seq id nos：47-51、56-57、或76-78中的任意一个有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多肽序列。

83、在某些实施方式中，所述抗原结合域为人源化的且包括：

84、(1)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

85、(2)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

86、(3)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

87、(4)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

88、(5)具有seq id no:43多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

89、(6)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

90、(7)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

91、(8)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

92、(9)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

93、(10)具有seq id no:44多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

94、(11)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

95、(12)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

96、(13)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

97、(14)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

98、(15)具有seq id no:45多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

99、(16)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:47多肽序列的轻链可变区；

100、(17)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:48多肽序列的轻链可变区；

101、(18)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:49多肽序列的轻链可变区；

102、(19)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:50多肽序列的轻链可变区；

103、(20)具有seq id no:46多肽序列的重链可变区和具有seq id no:51多肽序列的轻链可变区；

104、(21)具有seq id no:52多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

105、(22)具有seq id no:52多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

106、(23)具有seq id no:53多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

107、(24)具有seq id no:53多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

108、(25)具有seq id no:54多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

109、(26)具有seq id no:54多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

110、(27)具有seq id no:55多肽序列的重链可变区和具有seq id no:56多肽序列的轻链可变区；

111、(28)具有seq id no:55多肽序列的重链可变区和具有seq id no:57多肽序列的轻链可变区；

112、(29)具有seq id no:72的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76的多肽序列的轻链可变区；

113、(30)具有seq id no:72的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77的多肽序列的轻链可变区；

114、(31)具有seq id no:72多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

115、(32)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

116、(33)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；

117、(34)具有seq id no:73多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

118、(35)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

119、(36)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；

120、(37)具有seq id no:74多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区；

121、(38)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:76多肽序列的轻链可变区；

122、(39)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:77多肽序列的轻链可变区；或

123、(40)具有seq id no:75多肽序列的重链可变区和具有seq id no:78多肽序列的轻链可变区。

124、在某些实施方式中，所述抗原结合域是单链可变片段(scfv)。

125、在某些实施方式中，所述抗原结合域是人源化单链可变片段(scfv)。

126、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体(car)包含一个或多个抗原结合域。

127、在某些实施方式中，所述胞内信号转导域包括一个或多个共刺激域和一个或多个激活域。

128、本发明还提供了由本发明的分离的多核苷酸编码的嵌合抗原受体(cars)。

129、本发明还提供了包含分离的多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含编码cars的核酸。

130、本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞。

131、在某些实施方式中，宿主细胞是t细胞，优选地，人t细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是nk细胞，优选地，人nk细胞。例如，t细胞或nk细胞可以被改造为表达本发明的car的细胞来治疗诸如癌症之类的疾病。

132、本发明还提供了制备表达本发明嵌合抗原受体(car)的宿主细胞的方法。所述方法包括用含有编码本发明所述cars的分离核酸的载体转导t细胞或nk细胞。

133、本发明还提供了制备本发明car-t细胞或car-nk细胞的方法。所述方法包括在制备car-t细胞或car-nk细胞的条件下，培养含有分离的的多核苷酸的t细胞或nk细胞，该多核苷酸含有编码本发明的嵌合抗原受体(car)的核酸，并且回收car-t细胞或car-nk细胞。

134、本发明还提供了制备包含本发明嵌合抗原受体(car)的rna工程化细胞群的方法。所述方法包括将细胞与含有编码嵌合抗原受体(car)的核酸的分离多核苷酸接触，其中分离的多核苷酸是体外转录的rna或合成rna。

135、本发明还提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括给受试者施用本发明的car-t细胞和/或car-nk细胞。所述癌症可以是任何液体或实体癌症,例如，它可以选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、间皮瘤和其他实体肿瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)和其他液体肿瘤。

136、在某些实施方式中，在有需要的受试者中治疗癌症的方法还包括向有需要的受试者施用药物，所述药物使细胞表达car分子的效率增加。

137、在某些实施方式中，在有需要的受试者中治疗癌症的方法进一步包括向有需要的受试者施用药物，所述药物可改善一种或多种副作用，所述副作用与施用表达car分子的细胞有关。

138、在某些实施方式中，在有需要的受试者中治疗癌症的方法进一步包括向有需要的受试者施用药物，所述药物用于治疗与间皮素相关的疾病。