一种3-岩藻糖基乳糖的分批补料发酵生产方法与流程

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种3-岩藻糖基乳糖的分批补料发酵生产方法。

背景技术：

1、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-fl），cas 登记号 41312-47-4，是一种白色至象牙色粉末。作为母乳低聚糖的主要成分之一，3-fl具有调节肠道菌群等作用，在婴幼儿食品行业具有广阔应用前景。与对2'-岩藻糖基乳糖的广泛研究相比，目前业内对3-fl研究报道较少。但根据安全性评估，3-fl无急性口服毒性、遗传毒性和亚急性毒性，已被公认为安全物质(《safety of 3-fl (3-fucosyllactose) as a novel food pursuant toregulation (eu) 2015/2283》，请见efsa j. 期刊2021年19卷6期e06662)。美国食品药品监督管理局已受理并通过3-fl相关婴幼儿用产品的注册申请，例如grn000925。3-fl成为200多种母乳低聚糖中，目前为止已实现商业化的7种母乳低聚糖之一。该产品中3-fl采用基因工程改造的大肠埃希氏菌( escherichia coli) bl21（de3）菌株dsm 33491生产，对dsm33491删除了一个基因片段，并插入五个编码糖代谢功能的基因。

2、除上述菌株外，关于其他菌株用于生产3-fl的研究也时有报道，例如孙俊松等构建了重组枯草芽孢杆菌用于3-fl的发酵生产(cn114438001a)；郝占西等构建了敲除β半乳糖苷酶基因的大肠埃希氏菌用于3-fl的发酵生产（cn112662604a）；沐万孟等构建了表达α1,3岩藻糖基转移酶的大肠埃希氏菌用于3-fl的发酵生产（cn114107152a）；宗剑飞等构建了一种大肠埃希氏菌基因工程菌用于3-fl的发酵生产(cn2022116286408、pct/cn2023/087185)。

3、不同大肠埃希氏菌基因工程菌因代谢途径等已进行不同的基因修改，其生物学特征发生改变，因此其发酵生产方法存在差异，例如cn114107152a公布的菌株使用甘油发酵体系，并添加异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl β-d-thiogalactoside，iptg)和乳糖；其发酵工艺中细胞密度指标od600nm可达到60，3-fl产量最高可达20.3g/l。cn114438001a公布的菌株可使用甘油、葡萄糖等发酵体系，3-fl产量最高可达6.2g/l。cn2022116286408的菌株使用甘油发酵体系，未经优化的发酵工艺测试显示，其3-fl产量约为对比菌株的2倍以上，但产量仍然较低，且发酵速率较慢。目前关于3-fl发酵生产工艺的研究报道仍然较少，其工业化生产的产量和产率仍有待提高，以适应日益增长的市场需求。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的是对3-岩藻糖基乳糖的发酵生产工艺进行改进，以提高其单位时间内3-岩藻糖基乳糖的产量。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种3-岩藻糖基乳糖的分批补料发酵生产方法，该方法采用大肠埃希氏菌hcyj-08进行3-岩藻糖基乳糖的发酵生产，该大肠埃希氏菌菌株保藏编号为：cgmcc no. 27189；保藏日期为2023年04月23日；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经鉴定分类属于大肠埃希氏菌 escherichia coli。

4、所述生产方法以甘油为碳源。所述生产方法的补料策略为：当发酵培养基中（即发酵罐的发酵液中）甘油浓度<10g/l 时向发酵培养基中流加甘油，使发酵培养基中甘油终浓度不低于20g/l；细胞密度指标od600nm达到20时，降低温度至诱导温度32℃，同时向发酵培养基中流加异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷和a-乳糖母液使发酵培养基中乳糖终浓度达到10g/l；监测发酵培养基中乳糖的浓度，当乳糖浓度<5g/l时，向发酵培养基中流加a-乳糖使发酵培养基中乳糖浓度不低于10g/l；所述a-乳糖母液单独配制，升温至60℃加入氢氧化钠调节ph至10~11，然后115℃灭菌30min后降温至60℃保温，用于流加程序；监测发酵培养基的ph和溶氧量，流加ph调节剂控制发酵培养基的ph为6.6~6.8，控制通气量为1.0vvm~2.0vvm、搅拌桨转速200rpm~700rpm。

5、优选地，所述生产方法的发酵培养基组成为：甘油 20g/l、kh2po4 5g/l、k2hpo45g/l、(nh4)2so4 4.0g/l、一水合柠檬酸 1.7g/l、mgso4·7h2o 1.4g/l、硫胺素 4.5mg/l 和体积百分比为1%的微量元素，用氢氧化钠调至 ph 6.8；其中微量元素液组成为：feso4·7h2o 10g/l、znso4·7h2o 2.2g/l、cuso4·5h2o 1.0g/l、mnso4·h2o 0.38g/l、na2b4o7·10h2o 0.02g/l、(nh4)6mo7o24 0.1g/l 和 cacl2 2.0g/l，溶解于5 mol/l 盐酸。

6、优选地，所述生产方法使用的碳源补料液为：甘油 800g/l；所述生产方法使用的a-乳糖母液溶剂为水，a-乳糖母液中a-乳糖浓度为650g/l。

7、优选地，所述生产方法的流加用ph调节剂为体积百分比为50%的氨水。

8、优选地，当发酵培养基降低温度至诱导温度32℃时，向发酵培养基中流加异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷事发酵培养基中异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷液终浓度为0.2 mmol/l。

9、优选地，所述生产方法的发酵罐中种子培养液接种量为3%。

10、有益效果

11、本发明在3-岩藻糖基乳糖分批补料发酵工艺研究中发现，通过补料策略的改进有利于提高3-岩藻糖基乳糖的产量，对a-乳糖补料液的预处理提高了单位时间内3-岩藻糖基乳糖的产量，有利于提高3-岩藻糖基乳糖的生产效率，更好的满足市场需求。

12、实施方式

13、下面通过具体实施例对本发明的方案进行更详细的展示和说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

14、以下实施例中，发酵培养基中乳糖和3-岩藻糖基乳糖的浓度检测采用hplc法，hplc分析所用色谱柱为carbohydrate es 5u 250mmx4.6mm，检测器为蒸发光检测器，流动相为70%乙腈（乙腈：水），流速为0.8ml/min，柱温设定为30℃，进样量为5µl。也可采用文献报道的方法进行检测：christensen as , skov sh , lendal se ,  et al. quantifyingthe human milk oligosaccharides 2'‐fucosyllactose and 3‐fucosyllactose indifferent food applications by high‐performance liquid chromatography withrefractive index detection[j]. journal of food science, 2020, 85(2):332-338。以下实施例中，发酵培养基中甘油浓度、ph、溶氧量等均采用发酵罐配套的传感分析仪监测。

15、实施例1菌株hcyj-08即大肠埃希氏菌cgmcc no.27189的构建

16、由于申请日前中国专利申请cn2022116286408的大肠埃希氏菌菌株tkyw3(ptrc99a-p trc- futa- manc)即本发明所述的菌株hcyj-08(大肠埃希氏菌cgmcc no.27189)构建方法尚未公布。本部分引述中国专利申请cn2022116286408的内容，对菌株hcyj-08即大肠埃希氏菌cgmcc no.27189的构建进行说明，本实施例中引物序列的书写顺序均为5’端至3’端。本实施例中涉及的核苷酸序列号和氨基酸序列号汇总如下：

17、p lac启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:1所示； laci的核苷酸序列如sequenceidnumber:2所示； lacz的核苷酸序列如sequenceidnumber:3所示；p trc启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:4所示； wcag的核苷酸序列如sequenceidnumber:5所示； gmd的核苷酸序列如sequenceidnumber:6所示； lacy的核苷酸序列如sequenceidnumber:7所示； adhe的核苷酸序列如sequenceidnumber:8所示； mana的核苷酸序列如sequenceidnumber:9所示； manb的核苷酸序列如sequenceidnumber:10所示； wcaj的核苷酸序列如sequenceidnumber:11 所示； cat基因及其启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:12所示； nudd基因核苷酸序列如sequenceidnumber:13所示； seta基因核苷酸序列如sequenceidnumber:14所示；第44位异亮氨酸突变为丝氨酸的甲硫氨酸氨肽酶突变体（mapile44ser）氨基酸序列如sequenceidnumber:15所示；p ara启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:16所示； manc的核苷酸序列如sequenceidnumber:17所示； futc的核苷酸序列如sequenceidnumber:18所示；质粒ptrc99a-p trc- futc- manc的核苷酸序列如sequenceidnumber:19所示；人工合成的含 futa的基因片段核苷酸序列如sequenceidnumber:20； futa基因片段核苷酸序列如sequenceidnumber:21；编码甲硫氨酸氨肽酶突变体（mapile44ser）的基因片段核苷酸序列如sequenceidnumber:22所示；氯霉素抗性基因的启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:23所示；野生型甲硫氨酸氨肽酶的氨基酸序列如sequenceidnumber:24所示。

18、1.1构建菌株tkyw2-2

19、在专利文献cn112501106a中所述大肠埃希氏菌w2（ e.coli k12 mg1655△ laciz::p trc- wcag-gmd-lacy, △ adhe::p trc- manb-mana）的基础上，敲除基因组上的udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因 wcaj和gdp-甘露糖水解酶编码基因 nudd，进一步在基因组原位过表达糖流出转运蛋白基因 seta，构建出菌株tkyw2-2。

20、cn112501106a中大肠埃希氏菌w2是以大肠埃希氏菌k12 mg1655( escherichia  coli k12 mg1655)为出发菌株构建，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的p lac启动子序列及调节基因 laci和 β-半乳糖苷酶编码基因 lacz，在原 lacz位点之后以p trc启动子过表达gdp-岩藻糖合成酶编码基因 wcag、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因 gmd和 β-半乳糖苷透性酶编码基因 lacy得到w1菌株，进而在乙醇脱氢酶编码基因 adhe位点上以p trc启动子过表达磷酸甘露糖异构酶编码基因 mana和磷酸甘露糖变位酶编码基因 manb得到w2菌株。

21、1.1.1构建菌株w2△ wcaj

22、使用菌株w2作为出发菌株，利用crispr/cas9技术敲除 wcaj（核苷酸序列如sequenceidnumber:11所示）。实验中所用的crispr/cas9技术参考前期的研究报道(zhaod,  et al. crispr/cas9-assisted grna-free one-step genome editing with nosequence limitations and improved targeting efficiency. sci rep 7, 16624)。首先，构建第一步同源重组片段，包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因 cat和通用的n20+ngg序列（tagtccatcgaaccgaagtaagg），将第一步同源重组片段通过电转化导入含有pcago质粒的w2菌株中，进行第一步重组，pcago质粒含有重组酶基因，以及cas9和grna基因等(zhao d, et al. crispr/cas9-assisted grna-free one-step genome editing with nosequence limitations and improved targeting efficiency. sci rep 7, 16624)。挑选正确克隆，进行第二次同源重组。挑取第二次同源重组后的正确克隆，传代丢失pcago质粒，从而获得敲除 wcaj基因的w2△ wcaj菌株。

23、以下详细描述具体方法：

24、(1)第一步同源重组片段的构建。以大肠埃希氏菌菌株 e. coli k12 mg1655基因组（genebank accession no. nc_000913）为模板，分别利用表1中的引物up-1和up-2，以及引物down-1和down-2，pcr扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以实验室保存的一株带有氯霉素抗性基因 cat（核苷酸序列如sequenceidnumber:12所示，sequenceidnumber:12为 cat基因及其启动子的核苷酸序列）的菌株基因组为模板，利用引物cat-1和cat20-2进行pcr扩增，获得带有 cat-n20序列的片段。以上、下游同源臂，带有 cat-n20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物up-1和down-2进行重叠pcr扩增，得到第一步同源重组片段。

25、(2)第一步同源重组。利用常规的质粒转化法将pcago质粒转化到菌株w2中，获得菌株w2 (pcago)。利用含有1%葡萄糖以及浓度为0.1 mm的iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷）的lb培养基制备w2 (pcago)感受态，利用电转化方法导入第一次同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/l氨苄青霉素和25 mg/l氯霉素，以及1%葡萄糖的lb平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落pcr鉴定，获得正确的第一步同源重组菌株。

26、(3)第二步同源重组。将第一步同源重组菌株接种到含有100 mg/l氨苄青霉素、0.1 mm的iptg以及2g/l阿拉伯糖的lb液体培养基中，在30℃培养6h以上，平板划线分离单菌落，筛选出能够在含有100 mg/l氨苄青霉素的lb平板上生长，但是在含有25 mg/l氯霉素的lb平板上不能够生长的克隆。测序验证发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pcago质粒，从而获得菌株w2△ wcaj。

27、表1 敲除 wcaj基因所用引物

28、

29、1.1.2构建菌株w2△

30、在大肠埃希氏菌菌株w2△ wcaj的基础上，利用与上述crispr/cas9技术同样的方法，敲除基因组上的 nudd基因（核苷酸序列如sequenceidnumber:13所示），构建出菌株w2△ wcaj△ nudd，命名为zkyw1。以下详细描述具体方法：

31、(1)第一步同源重组片段的构建。以菌株 e.  coli k12 mg1655基因组为模板，分别利用表2中的引物对nup-1和nup-2，引物对ndown-1和ndown-2，pcr扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株w2△ wcaj时获得的带有 cat-n20序列的片段为模板，利用表2中的引物ncat-1和ncat20-2进行pcr扩增，获得新的带有 cat-n20序列的片段。以上、下游同源臂，新的带有 cat-n20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物nup-1和ndown-2进行重叠pcr扩增，得到第一步同源重组片段。

32、(2)第一步同源重组。利用常规的质粒转化法将pcago质粒转化到菌株w2△ wcaj中，获得菌株w2△ wcaj (pcago)。利用含有1%葡萄糖以及浓度为0.1 mm的iptg的lb培养基制备w2△ wcaj (pcago)感受态，利用电转化方法导入第一次同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/l氨苄青霉素和25 mg/l氯霉素，以及1%葡萄糖的lb平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落pcr鉴定，获得正确的第一步同源重组菌株。

33、(3)第二步同源重组。与上述敲除 wcaj基因时第二部同源重组的步骤相同。测序验证获得发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pcago质粒，从而获得菌株w2△ wcaj△ nudd，命名为tkyw1。

34、表2 敲除 nudd基因所用引物

35、

36、1.1.3构建菌株tkyw2-2

37、在菌株tkyw1的基础上，利用与上述crispr/cas9技术同样的方法，在糖流出转运蛋白 seta基因（核苷酸序列如sequenceidnumber:14所示）前面插入组成型启动子p j23110 (http://parts.igem.org/part:bba_j23100)，启动子p j23110 序列为：tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc；同时，在利用crispr/cas9进行第二次重组时，保留了氯霉素抗性基因的启动子（核苷酸序列如sequenceidnumber:23所示），以实现双启动子对 seta进行原位过表达，所获菌株命名为tkyw2-2。

38、(1)第一步同源重组片段的构建。以菌株 e.  coli k12 mg1655基因组为模板，分别利用表3中的引物对sup-1和sup-2，引物对sdown-1和sdown-2为引物，分别pcr扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株w2△ wcaj时获得的带有 cat-n20序列的片段为模板，利用表3中的引物scm-1和scm-2进行pcr扩增，获得带有 cat基因序列的片段。以n20-1为上游引物，以110-2为下游引物，不使用模板，进行pcr扩增，获得带有p j23110启动子的基因片段。以sup-1和sdown-2为引物，利用上述pcr扩增得到的上游同源臂、带有 cat基因序列的片段、带有p j23110启动子的基因片段、以及下游同源臂，共4个片段为模板，进行重叠pcr扩增，得到第一步同源重组用的片段。

39、表3 构建在基因组上过表达 seta基因的菌株所用引物

40、

41、(2)第一步同源重组。利用常规的质粒转化法将pcago质粒转化到菌株tkyw1中，获得菌株tkyw1 (pcago)。利用含有1%葡萄糖和浓度为0.1 mm的iptg的lb培养基制备tkyw1(pcago)感受态，利用电转化方法分别导入上述第一次同源重组用的片段，转化后的菌液分别涂布于含100 mg/l氨苄青霉素和25 mg/l氯霉素，以及1%葡萄糖的lb平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落pcr鉴定，获得正确的第一步同源重组的菌株。

42、(3)第二步同源重组。与上述敲除 wcaj基因时第二部同源重组的步骤相同。测序验证获得发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pcago质粒，从而获得带有p j23110启动子的菌株，命名为tkyw2-2。

43、1.2构建菌株tkyw3

44、大肠埃希氏菌k12 mg1655的野生型甲硫氨酸氨肽酶氨基酸序列如sequenceidnumber:24所示。在菌株tkyw2-2 的基础上，利用与上述crispr/cas9技术同样的方法，对基因组上的甲硫氨酸氨肽酶基因 map进行点突变。将其翻译蛋白的第44位异亮氨酸突变为丝氨酸（mapile44ser），对应甲硫氨酸氨肽酶突变的氨基酸序列如sequenceidnumber:15所示，构建出的菌株命名为tkyw3。

45、1.2.1第一步同源重组片段的构建

46、以实验室保存的一株带有 map基因点突变的mg1655突变株mg1655 mapt131g（ mapt131g核苷酸序列如sequenceidnumber:22所示）为模板，分别利用表4中的引物对mup-1和mup-2，引物对mdown-1和mdown-2为引物，pcr扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株w2△ wcaj时pcr获得的带有 cat-n20序列的片段为模板，利用引物mcat-1和mcat20-2进行pcr扩增，获得新的带有 cat-n20序列的片段。以上、下游同源臂，新的带有 cat-n20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物mup-1和mdown-2进行重叠pcr，得到第一次同源重组片段，该片段含有 map基因的点突变，即野生型 map基因的第131位碱基由t变为g。

47、1.2.2第一步同源重组

48、利用常规的质粒转化法将pcago质粒转化到菌株tkyw2-2中，获得菌株tkyw2-2(pcago)。利用含有1%葡萄糖和浓度为0.1 mm的iptg的lb培养基制备tkyw2-2 (pcago)感受态，利用电转化方法导入第一次同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/l氨苄青霉素和25 mg/l氯霉素，以及1%葡萄糖的lb平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落pcr鉴定，获得正确的第一步同源重组菌株。

49、1.2.2第二步同源重组

50、与上述敲除 wcaj基因时第二步同源重组的步骤相同。测序验证获得发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pcago质粒，从而获得菌株tkyw2-2  mapt131g，命名为tkyw3。

51、表4 构建 map基因点突变菌株所用引物

52、

53、1.3 构建质粒 ptrc99a-p trc- futc- manc

54、以专利文献cn112501106a中所述质粒ptrc99a- futc-manc为模板（质粒ptrc99a- futc-manc构建涉及的p trc启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:4所示；阿拉伯糖诱导型启动子p ara启动子的核苷酸序列如sequenceidnumber:16所示；甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因 manc的核苷酸序列如sequenceidnumber:17所示；2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因 futc的核苷酸序列如sequenceidnumber:18所示），以表5中的darac-f和darac-r为引物进行pcr扩增，将pcr产物进行纯化和回收后，使用无缝克隆酶（peasy-uniseamlesscloning and assembly kit，北京全式金生物技术有限公司）自接，转化到大肠埃希氏菌 e. coli jm109感受态细胞中，在含有100 mg/l氨苄青霉素的lb平板上培养，挑取转化子测序验证，获得正确的重组质粒，命名为质粒ptrc99a-p trc- futc- manc，其核苷酸序列如sequenceidnumber:19所示。

55、表5 构建质粒ptrc99a-p trc- futc- manc所用引物

56、

57、1.4 质粒ptrc99a-p trc- futa- manc构建

58、利用幽门螺杆菌（ helicobacter pylori）nctc 11637来源的α-(1,3)-岩藻糖基转移酶基因 futa替换质粒ptrc99a-p trc- futc- manc中的 futc，构建出质粒ptrc99a-p trc- futa- manc。futa能够以gdp-岩藻糖与乳糖为底物催化产生3-岩藻糖基乳糖。

59、以质粒ptrc99a-p trc- futa- manc为模板，以表6中的futa-zt-f和futa-zt-r为引物进行pcr扩增，得到去除 futc的线性载体片段。以人工合成的含有 futa基因片段（核苷酸序列如sequenceidnumber:20所示）的载体为模板（该基因片段包含如sequenceidnumber:21所示的 futa基因），以futa-f和futa-r为引物进行pcr扩增，获得带有 futa基因的片段。将上述两种pcr产物进行纯化和回收后，使用无缝克隆酶连接，转化到 e. coli jm109感受态细胞中，在含有100 mg/l氨苄青霉素的lb平板上培养，挑取转化子测序验证，获得正确的重组质粒，命名为ptrc99a-p trc- futa- manc。

60、表6 构建质粒ptrc99a-p trc- futa- manc所用引物

61、

62、1.5 3-岩藻糖基乳糖生产菌株hcyj-08即大肠埃希氏菌cgmcc no.27189的构建

63、利用电转化的方法，将质粒ptrc99a-p trc- futa- manc导入tkyw3，构建出3-岩藻糖基乳糖生产菌株tkyw3 (ptrc99a-p trc- futa- manc)，命名为hcyj-08即大肠埃希氏菌cgmccno.27189。

64、实施例2 3-岩藻糖基乳糖的分批补料发酵生产方法比较

65、生产菌株：hcyj-08即大肠埃希氏菌cgmcc no.27189。

66、种子/发酵培养基：甘油 20g/l、kh2po4 5g/l、k2hpo4 5g/l、(nh4)2so4 4.0g/l、一水合柠檬酸 1.7g/l、mgso4·7h2o 1.4g/l、硫胺素 4.5mg/l 和微量元素 1% (v/v)，用氢氧化钠调至 ph 6.8。微量元素液：feso4·7h2o 10g/l、znso4·7h2o 2.2g/l、cuso4·5h2o 1.0g/l、mnso4·h2o 0.38g/l、na2b4o7·10h2o 0.02g/l、(nh4)6mo7o24 0.1g/l 和 cacl2 2.0g/l，溶解于5 mol/l盐酸。

67、分批补料发酵补料液：（1）补料碳源：甘油800 g/l；（2）补料乳糖：乳糖 650 g/l，先升至60℃用氢氧化钠调ph至10~11，然后115℃灭菌30min，灭菌完毕后降温至60℃保温；

68、ph 调节剂：50%氨水(v/v)。

69、培养步骤：

70、一级种子摇瓶：取hcyj-08甘油管菌株接种于种子培养基，在37℃，摇床转速180rpm条件下培养12h得一级种子培养液。

71、二级种子摇瓶：将一级种子培养液按2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在37℃，180rpm条件下培养8h得二级种子培养液即种子液。

72、发酵罐培养：

73、采用100l发酵罐，加入发酵培养基40l，按3%（v/v）接种量将二级种子培养液即种子液接种至发酵培养基。该反应器中采用甘油限制型培养基，研究表明，甘油相对于葡萄糖更适用于作为3-岩藻糖基乳糖(3-fl)生产的碳源，同时为 3-fl 的前体物质 gdp-l-岩藻糖的合成提供了骨架，其作为唯一的碳源，在细胞生长和中间体合成中起到了重要作用。

74、本次反应中，随着底物的消耗，甘油的浓度逐渐下降，通过生物传感分析仪监测生物反应体系中的甘油浓度，当甘油浓度低于10 g/l 时流加甘油，使其终浓度不低于 20 g/l。

75、当生物反应器中的细胞密度指标od600nm达到20时，降低温度至诱导温度32℃，同时流加异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷（即iptg）和a-乳糖母液使发酵培养基中乳糖终浓度达到10 g/l，iptg终浓度为0.2 mmol/l。同时通过 hplc 监测发酵液中乳糖浓度，当乳糖浓度低于5 g/l时，流加乳糖保证其浓度不低于10 g/l。

76、本工艺采用的分批补料发酵中，通过计算机设置程序，实时检测发酵体系中的ph指标和溶氧量，通过关联程序控制ph调节剂氨水按一定速度流加至发酵体系中，以此控制发酵体系中的ph指标维持在6.7±0.1。通过关联程序检测溶氧量来控制通气量范围为1.0vvm ~2.0 vvm 和搅拌桨转速为200rpm~700 rpm。通过对重组菌株 hcyj-08的100l发酵罐发酵，以及过程中对乳糖、甘油和 3-fl的浓度监测，以及对生物反应器中细胞浓度的跟踪，得到 3-fl 工程重组菌株的分批补料发酵结果。

77、发酵10小时后，在 600 nm 处的细胞密度（od600nm）为20。随后加入终浓度为0.2mmol/l的iptg 诱导相关酶的表达。并同时添加终浓度为 10 g/l 的a-乳糖作为底物。 在发酵体系中3-fl的产量不再增加时，结束发酵。最终，3-fl 在发酵罐中的浓度达到了52.71g/l，细胞密度最大达到了72.70。

78、另设对照发酵工艺，a-乳糖母液灭菌后不进行60℃保温及naoh预处理，其他条件相同。

79、两种工艺的发酵过程检测结果分别见表7和表8。由表7可见a-乳糖母液预处理后进行分批补料发酵的工艺，单位时间内3-fl产量高于对照发酵工艺。由表8可见，a-乳糖母液预处理后进行分批补料发酵的工艺，单位时间内细胞密度指标od600nm与对照发酵工艺差异较小。

80、表7 两种发酵工艺的3-fl产量动态检测结果

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82、表8两种发酵工艺的细胞密度od600nm动态检测结果

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84、以上所述仅为本发明的较佳实施例，不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。