一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体及其应用的制作方法

本发明涉及生物纳米颗粒外泌体，具体为一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体及其应用。

背景技术：

1、骨关节炎作为一种常见且影响广泛的退行性关节疾病，给患者的生活质量带来了严重的负面影响。目前，骨关节炎的传统治疗方法主要包括药物缓解症状、物理治疗以及在严重情况下进行手术干预等。然而，这些方法往往只能在一定程度上减轻疼痛和改善关节功能，对于阻止疾病的进展以及促进受损关节软骨的修复效果有限。

2、在骨关节炎的病理生理过程中，氧化应激起着关键的推动作用。氧化应激会导致软骨细胞外基质的直接降解，破坏维持软骨结构完整性和功能的关键成分如胶原蛋白和蛋白多糖。这不仅使得软骨的厚度和弹性下降，引发关节疼痛和僵硬，还会打破关节内合成代谢和分解代谢的平衡，抑制基质成分的合成，同时促进分解代谢因子的表达，进一步加速软骨的降解，阻碍其自身的修复机制。

3、滑膜组织在骨关节炎的发展中具有重要地位。滑膜排列在关节囊的内表面，不仅能分泌滑膜液来润滑关节，还能为关节软骨提供必要的营养素和生长因子，从而在正常状态下维持软骨的健康和功能。在骨关节炎发生时，滑膜会释放促炎细胞因子和酶，这些物质会进一步加剧软骨的降解和促进关节炎症的发展，形成一个恶性循环，加重骨关节炎的症状。

4、外泌体作为细胞间通信的关键媒介，由细胞分泌到细胞外环境中，携带多种生物活性物质，如蛋白质、核酸等。在生物医药领域，外泌体具有潜在的治疗应用价值，尤其是在组织修复和再生方面展现出了一定的潜力。然而，现有的外泌体在改善骨关节炎方面的研究和应用尚存在不足。一方面，对于外泌体的来源和制备方法缺乏优化，导致其在治疗骨关节炎时的效果不够理想；另一方面，缺乏有效的传递系统来确保外泌体能够准确地到达关节病变部位并持续发挥作用。

5、因此，迫切需要研发一种新的基于生物纳米颗粒衍生的外泌体及其应用方法，以更有效地改善骨关节炎的症状和延缓疾病的进展，为骨关节炎的治疗提供一种创新且更有前景的解决方案。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体及其应用。

3、（二）技术方案

4、一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体的制备方法：

5、细胞培养步骤：

6、培养小鼠滑膜成纤维细胞，将其来源限定为hycyte，使用100 nm的sod3模拟物对照物质进行处理；

7、从8周龄小鼠的软骨中分离软骨细胞，并在含10%胎牛血清的dmem/f12培养基中培养，其中软骨细胞的分离过程为先使用无菌刀片将软骨切成1 mm3碎片，然后在含有2 mg/ml ii型胶原酶thermo的dmem/f12培养基中消化6 h，消化后的细胞进行离心处理后再进行培养；

8、外泌体分离步骤：

9、从第3-6代的经上述处理的小鼠滑膜成纤维细胞中分离出外泌体，先从2×107细胞培养物上清液中依次进行300 g离心10 min去除细胞、3000 g离心15 min丢弃细胞碎片，之后将上清液以12万g离心1h，用pbs洗涤颗粒以去除污染物，最后在12万g下再次离心70min，纯化后的颗粒在200 µl的pbs中重悬，并在-80℃下保存。

10、优选的，所述外泌体具有圆形凸形结构，其粒径范围通过纳米颗粒跟踪分析确定为特定区间；

11、通过western印迹法检测显示外泌体标记物cd9、cd63、tsg101呈阳性标记，且经sod3模拟物处理的滑膜成纤维细胞来源的外泌体中sod3含量显著高于对照处理的滑膜成纤维细胞来源的外泌体。

12、优选的，所述外泌体在制备治疗骨关节炎的药物或医疗器械中的应用；

13、体外应用：

14、软骨细胞用10 ng/ml的il-1β刺激，用10 µg/ml外泌体处理，检测mitoros和活性氧ros的水平，软骨细胞外基质ecm合成相关基因col2a1和acan的表达以及基质降解相关基因mmp13和adamts5的表达；

15、体内应用：

16、在建立的小鼠oa模型中，通过手术对小鼠进行特定处理后，每两周在关节内注射含有本发明外泌体的微球，检测关节软骨糖胺聚糖、sod3和acan的表达水平。

17、优选的，在制备含有外泌体的微球时，采用以下步骤及参数：

18、制备微球的原料包含10 wt% gelma、光引发剂和5 wt% span80油，在微流控装置中处理形成均匀大小的液滴，通过紫外线照射使液滴交联；

19、将合成的微球用75%的乙醇溶液洗涤，并保存在去离子水中；

20、为进行表面改性，将微球浸泡在聚多巴胺pda溶液（2 mg/ml在10 mm tris盐酸，ph8.5）中6小时形成具有特定特性和功能的改性微球。

21、（三）有益的技术效果

22、本发明通过特定的细胞培养和外泌体分离方法，制备出具有高质量和高活性的用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体。

23、本发明通过在体外细胞实验中应用该外泌体，显著降低了软骨细胞内的 mitoros和 ros 水平，阻止氧化应激对软骨细胞的损伤，同时增加了软骨细胞外基质关键成分的表达，上调了 ecm 合成相关基因并降低了基质降解相关基因的表达。

24、本发明通过将外泌体与特定微球制备技术相结合，在小鼠 oa 模型体内实验中，实现了外泌体在关节内的有效传递和缓慢释放，显著保留了关节软骨中的糖胺聚糖表达，增加了关键蛋白 sod3 的表达，有效缓解了骨关节炎的严重程度。

25、本发明通过以上创新设计和应用方式，为骨关节炎的治疗提供了一种全新的、多方位有效的解决方案，有望在临床应用中发挥重要作用，改善患者生活质量并减轻社会医疗负担。

1.一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体的制备方法，其特征在于：制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体具有圆形凸形结构，其粒径范围通过纳米颗粒跟踪分析确定为特定区间；

3.根据权利要求1或2所述的一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体的制备方法制备的外泌体的应用，其特征在于：所述外泌体在制备治疗骨关节炎的药物或医疗器械中的应用；

4.根据权利要求3所述的一种用于改善骨关节炎的生物纳米颗粒衍生外泌体的制备方法制备的外泌体的应用，其特征在于：