一种基于polyA金胶比色生物传感器及其检测方法和应用与流程

本发明属于生物传感器，具体涉及一种基于poly a金胶比色生物传感器及其检测方法和应用。

背景技术：

1、金纳米颗粒(aunps)由于其稳定性、易于合成和易于与生物分子(包括dna)功能化以及强的光吸收和散射特性，被广泛用作生物传感器中的一种替代信号报告剂。这些理想的特性促进了一系列分析物(包括金属离子、小分子和生物分子)的纳米金比色法分析的快速发展，能够以方便的方式进行可视化检测。

2、近年来出现了一种新的基于无巯基多聚腺嘌呤-aunps(poly a-au)相互作用的dna探针固定方法，以替代传统的巯基标记的dna探针。poly a在粘附过程中可以通过疏水塌陷的方式高亲和力地粘附在金表面，因此用poly a标记的dna探针可以很容易地固定在金表面上。

3、mirnas(micro-rnas)是存在于动物、植物和一些病毒中的非编码短rna，在基因表达调控领域具有至关重要的作用。先前的证据表明，mirnas是转录后的重要调节因子，通过靶基因降解或翻译抑制导致基因沉默。除了这种对基因表达的调控作用外，大量实验证实mirnas失调与某些类型的疾病有关。因此，高选择性和高灵敏度识别mirnas对于更好地鉴定和分析基因功能具有重要意义。

4、mirna中的let-7a被认为与癌症的发生和发展密切相关。开发用于癌症诊断和治疗的不精准医学方法具有重要意义。然而，由于血清样品浓度低，检测let-7a仍然受到限制。传统的检测方法已被用于检测mirna，例如northern印迹、微阵列技术和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)等。然而，这些方法通常具有时间成本高、选择性低或高度依赖酶等缺点。因此，需要开发灵敏、低成本的mirna检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于poly a金胶比色生物传感器及其检测方法和应用。本发明开发了一种比色法，通过滚环扩增反应(rca)辅助金纳米颗粒(aunps)实现了对mirna的超灵敏和特异性检测，本发明的检测方法具有低成本、简单快速，rca反应的温和条件等优势，在临床诊断分析中具有重要的应用价值，有利于进行生物标志物的高灵敏检测。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于poly a金胶比色生物传感器检测mirna的方法，所述方法包括：

4、采用含有poly t的锁环探针捕获被检测mirna，进行滚环扩增，将滚环扩增产物与纳米金在高盐浓度和/或低盐浓度的反应体系中进行自组装结合形成具有网络结构的rca-dna-aunps聚合物；通过紫外-可见光谱法测量反应体系的吸收值；计算mirna标准溶液的标准曲线，基于标准曲线计算待测样品中mirna的浓度；

5、所述锁环探针中poly t序列的碱基数为10-30nt，例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt或29nt。

6、优选地，所述锁环探针中poly t序列的碱基数为15-25nt，例如可以是15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt或25nt，进一步优选为20nt。

7、本发明中，对mirna进行滚环扩增反应后，得到含有大量poly a的rca长单链，其中poly a具有高吸附亲和力直接组装到aunps表面，含有大量poly a的rca长单链与aunps结合，形成具有网络结构的rca-dna-aunps聚合物，aunps的聚集与否可以通过紫外-可见光谱法方便地测量。

8、本发明中，由于纳米金之间的距离与poly a之间碱基个数有关，因此可以通过改变模板上poly t的间的碱基个数来控制扩增后poly a之间的距离。随着poly a之间碱基个数的减少，溶液中纳米金间的距离逐渐减小，表示在结果为a525/a610比值减小，即聚集程度增大。当poly a的长度从10nt增加到20nt时，a525/a610比值增加，且当poly a数量为20nt时具有最高的信噪比，然而poly a的长度增加到30nt时，实验信号下降，这可能是因为较长的dna链影响了poly a与纳米金的结合效率。

9、优选地，所述吸收值为525-610nm处的吸收值。

10、优选地，所述高盐浓度的反应体系中含有0.05-0.11m无机盐，例如可以是0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m、0.1m或0.11m等。

11、优选地，所述低盐浓度的反应体系中含有0-0.01m无机盐，例如可以是0m或0.01m等。

12、本发明中，目标mirna存在时，mirna与挂锁探针结合形成环形模板，从而启动rca。由于挂锁探针含有连续t碱基，因此形成了具有大量poly a的rca产物，基于mirna的rca产物能够诱导dna-aunps组装形成具有网络结构的rca-dna-aunps聚合物。通过紫外分光光度计测定不同盐浓度下的rca-dna-aunps的吸光度。其中，高盐浓度的反应体系的a525/a610比值，记为a2；低盐浓度的反应体系的a525/a610比值，记为a1。并通过a1/a2实现对目标mirna的检测。该策略直接使用传统rca的圆形模板，简便易合成。所设计的结构提高了目标识别的特异性，且仅利用紫外分光光度计作为rca实验的信号输出系统，实现对信号的超灵敏检测。

13、优选地，所述含有poly t的锁环探针包括捕获序列1、poly t序列和捕获序列2。

14、优选地，所述捕获序列1的碱基数为8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕获序列1与靶标mirna的一端互补配对。

15、优选地，所述捕获序列2的碱基数为8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕获序列2与靶标mirna的一端互补配对。

16、优选地，所述滚环扩增反应包括如下步骤：

17、采用含有poly t的锁环探针捕获mirna，结合形成不完全闭合环状寡核苷酸，在连接酶的作用下形成完全闭合的环状挂锁探针；进行滚环扩增反应，得到含有poly a序列和与mirna互补配对的序列的滚环扩增产物。

18、优选地，所述滚环扩增反应的时间为1.5-2.5h，例如可以是1.5h、2h或2.5h等，优选为1.5h。

19、本发明中，滚环扩增时间也是影响实验结果的一个重要因素，rca产物的量及长度仅与rca时间有关，随着rca时间的延长，信号值逐渐增高，且随着rca产物的增多，poly a能够包裹更多纳米金，保护其在高盐环境中不聚沉。在一个实施例中在扩增时间达到1.5h时，信号值不再发生变化。

20、优选地，所述滚环扩增产物与纳米金自组装结合的反应体系包括：纳米金、bspp、无机盐和滚环扩增产物。

21、本发明中，在反应体系中加入bspp能够提高纳米金的稳定性，有利于后续检测。

22、优选地，所述反应体系中纳米金的终浓度为3-6nm，例如可以是3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm或6nm等。

23、优选地，所述反应体系中bspp的终浓度为0.2-0.4mg/ml，例如可以是0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml或0.4mg/ml等。

24、优选地，所述无机盐为nacl。

25、优选地，所述滚环扩增产物与纳米金自组装结合的反应时间为0.5-2.5h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h等，优选为1-2h。

26、本发明中，自组装结合的反应时间在2h之后，信号趋于稳定。

27、优选地，所述滚环扩增产物与纳米金自组装结合的反应温度为25-37℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等。

28、研究人员多用冷冻法来提高poly a与纳米金之间的结合能力及效率，为了研究不同温度条件对实验结果的影响，本发明选取了温度为25℃、37℃以及-80℃条件下的产物进行比较分析。结果表明，自组装结合的反应温度从25℃增加到37℃时，实验信号增加，而温度为-80℃时，实验信号降低。

29、优选地，所述基于poly a金胶比色生物传感器检测mirna的方法包括：

30、(a)采用含有poly t的锁环探针用于捕获被检测mirna，进行滚环扩增，所述锁环探针中poly t序列的碱基数为10-30nt；得到含有poly a序列和与mirna互补配对的序列的滚环扩增产物；

31、(b)将滚环扩增产物与纳米金在高盐浓度和/或低盐浓度的反应体系中进行自组装结合形成具有网络结构的rca-dna-aunps聚合物，通过紫外-可见光谱法测量反应体系在525-610nm处的吸收值；所述高盐浓度的反应体系中含有0.05-0.11m无机盐；所述低盐浓度的反应体系中含有0-0.01m无机盐；

32、(c)计算低盐浓度的反应体系的a525/a610比值，记为a1，根据不同浓度的mirna标准溶液的a1，作mirna浓度对数-a1的标准曲线，根据待测样品对应的低盐浓度的反应体系的a1计算所含mirna的浓度；

33、或，计算高盐浓度的反应体系的a525/a610比值，记为a2，根据不同浓度的mirna标准溶液的a2，作mirna浓度对数-a2的标准曲线，根据待测样品对应的低盐浓度的反应体系的a2计算所含mirna的浓度；

34、或，计算a1/a2的比值，作mirna浓度对数-a1/a2的比值的标准曲线，根据待测样品对应的a1/a2的比值计算所含mirna的浓度。

35、本发明中，poly a与纳米金有较强的结合能力，因此当大量有序间隔的poly a存在时，可以捕获溶液中的纳米金，使其成为串珠状，同时拉近了纳米金之间的距离，而利用紫外分光光度计便可以量化这一现象，其中a525/a610可以反映溶液中纳米金的聚集情况，比值越小也就意味着聚集程度增大。

36、本发明中，可以分别基于不同盐浓度下反应体系的吸收值a525/a610，建立mirna浓度对数-吸收值a525/a610的标准曲线，进行mirna的浓度的检测。

37、本发明的生物传感器在不同盐浓度下的聚集离散程度不同，利用这两种翻转的现象实现了信号的增强，将不同盐浓度下的紫外吸收值比值来确定被检测rna的量，且检测过程中纳米金无需格外修饰，这种方法大大提高了灵敏度，检测限(lod)为0.42fm。

38、具体地，当溶液中nacl浓度为0m时，随着poly a嵌段逐渐增多，能够拉近纳米金之间的距离，因此a525/a610呈现下降趋势。

39、而当溶液中nacl浓度增大时，包裹在纳米金表面的poly a能够保护其免受盐离子的干扰聚沉，因此当初始投料量相同时，溶液中的预成环序列能够利用少量的目标物成环，在后续rca过程中产生大量poly a缠绕在纳米金表面，因此a525/a610比值逐渐增大。

40、基于以上的两种信号相反的现象，本文利用二者比值，即a1/a2(a1为溶液中nacl浓度较低时的a525/a610，a2为nacl浓度增大时的a525/a610)进行信号放大，从而能够评估溶液中的目标物浓度，进行后续实际样品检测。

41、第二方面，本发明提供一种基于poly a金胶比色生物传感器，所述生物传感器包括：含有poly t的锁环探针、纳米金和被检测mirna；

42、所述含有poly t的锁环探针用于捕获被检测mirna，进行滚环扩增，得到含有polya序列和与mirna互补配对的序列的滚环扩增产物；所述锁环探针中poly t序列的碱基数为10-30nt，例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt或29nt；

43、所述纳米金用于与滚环扩增产物在高盐浓度和/或低盐浓度的反应体系中进行自组装结合形成具有网络结构的rca-dna-aunps聚合物；所述高盐浓度的反应体系中含有0.05-0.11m无机盐；所述低盐浓度的反应体系中含有0-0.01m无机盐。

44、其中，0.05-0.11m无机盐例如可以是0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m、0.1m或0.11m等；0-0.01m无机盐例如可以是0m或0.01m等。

45、优选地，计算所述生物传感器基于低盐浓度的反应体系的a525/a610比值a1，作mirna浓度对数-a1的标准曲线，计算待测样本中所含mirna的浓度；

46、或，计算所述生物传感器基于高盐浓度的反应体系的a525/a610比值a2，作mirna浓度对数-a2的标准曲线，计算待测样本中所含mirna的浓度；

47、或，计算所述生物传感器的a1/a2的比值，作mirna浓度对数-a1/a2的标准曲线，计算待测样本中所含mirna的浓度。

48、优选地，所述滚环扩增反应的时间为1.5-2.5h，例如可以是1.5h、2h或2.5h等，优选为1.5h。

49、优选地，所述含有poly t的锁环探针包括捕获序列1、poly t序列和捕获序列2。

50、优选地，所述捕获序列1的碱基数为8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕获序列1与靶标mirna的一端互补配对。

51、优选地，所述捕获序列2的碱基数为8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕获序列2与靶标mirna的一端互补配对。

52、优选地，所述单链dna大分子产物与纳米金结合的反应体系包括：纳米金、bspp、无机盐和单链dna大分子产物。

53、优选地，所述反应体系中纳米金的终浓度为3-6nm，例如可以是3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm或6nm等。

54、优选地，所述反应体系中bspp的终浓度为0.2-0.4mg/ml，例如可以是0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml或0.4mg/ml等。

55、优选地，所述无机盐为nacl。

56、优选地，所述滚环扩增产物与纳米金自组装结合的反应时间为0.5-2.5h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h等，优选为1-2h。

57、优选地，所述滚环扩增产物与纳米金自组装结合的反应温度为25-37℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等。

58、第三方面，本发明提供一种基于poly a金胶比色检测mirna的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的基于poly a金胶比色生物传感器。

59、第四方面，本发明提供第一方面所述的基于poly a金胶比色生物传感器检测mirna的方法、第二方面所述的基于poly a金胶比色生物传感器或第三方面所述的基于poly a金胶比色检测mirna的试剂盒中任意一种或至少两种的组合在mirna检测中的应用。

60、第五方面，本发明提供第二方面所述的基于poly a金胶比色生物传感器和/或第三方面所述的基于poly a金胶比色检测mirna的试剂盒在制备检测mirna的品中的应用。

61、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

62、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

63、本发明成功地开发了一种利用滚环扩增产物进行mirna比色检测的策略，扩增出的大量poly a在生物传感器中起着关键作用，poly a片段与纳米金显示出优异的吸附能力，相较于传统的sh-aunps提高了组装效率，简化组装流程。作为一种新的mirna检测策略，poly a-aunps方法显著降低了经济成本，并且可以通过修改探针序列来方便地扩展其功能。此外，该生物传感器的检测不需要特殊的仪器，是一种方便的光学检测方法，检测线可低至0.42fmol/l。不仅为mirna快速检测提供了的技术基础，同时对开发多功能poly a-aunps探针开辟了一条新的途径。