抗体药物缀合物及其制备方法与流程

1.一种用于生产部分再氧化的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个加帽半胱氨酸残基位于所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定结构域中。

3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两个或四个加帽半胱氨酸残基。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含位于所述抗体或其抗原结合片段的ch1区中的加帽半胱氨酸残基，

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个加帽半胱氨酸残基是一个或多个工程改造的表面暴露的半胱氨酸残基。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含位于所述抗体或其抗原结合片段的ch1区中残基152(eu编号)处的加帽半胱氨酸残基。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述一个或多个加帽半胱氨酸残基用半胱氨酸或谷胱甘肽加帽。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个脱帽半胱氨酸残基位于所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定结构域中。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两个或四个脱帽半胱氨酸残基。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含位于所述抗体或其抗原结合片段的ch1区中的脱帽半胱氨酸残基，

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一个或多个脱帽半胱氨酸残基是一个或多个工程改造的表面暴露的半胱氨酸残基。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含位于所述抗体或其抗原结合片段的ch1区中残基152(eu编号)处的脱帽半胱氨酸残基。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过使包含一个或多个加帽半胱氨酸残基的抗体或其抗原结合片段与还原洗涤缓冲液接触来还原所述一个或多个加帽半胱氨酸残基，从而提供包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的抗体或抗原结合片段。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述还原洗涤缓冲液包含5mm至50mm半胱氨酸，任选地其中所述还原洗涤缓冲液包含10mm至40mm、20mm至30mm、5mm至15mm、5mm至25mm、5mm至35mm、5mm至45mm、40mm至50mm、30mm至50mm、20mm至50mm、10mm至50mm、10mm至20mm、15mm至25mm、25mm至35mm、30mm至40mm，或35mm至45mm半胱氨酸，任选地其中所述还原洗涤缓冲液包含10mm、12mm、14mm、16mm、20mm、25mm或30mm半胱氨酸。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述还原洗涤缓冲液具有6.0至7.5的ph，任选地其中所述ph为6.5至7.2或6.8至7.0，任选地所述ph是6.9。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中包含一个或多个加帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段与所述还原洗涤缓冲液的接触在柱上进行，任选地所述柱是阳离子交换色谱柱。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述该方法进一步包括在与所述还原洗涤缓冲液接触后收集洗出液中的包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述洗出液具有5.5至6.0的ph，任选地所述ph为5.8。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述洗出液中的包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段的浓度为5g/l至25g/l，任选地其中所述洗出液中的包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段的浓度为8g/l至20g/l、10g/l至18g/l、12g/l至15g/l、5g/l至20g/l、5g/l至15g/l、5g/l至10g/l、20g/l至25g/l、15g/l至25g/l、10g/l至25g/l、10g/l至20g/l、13g/l至14g/l、或12g/l至15g/l，任选地其中所述洗出液中的包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段的浓度为5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、13.5g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、21g/l、22g/l、23g/l、24g/l或25g/l。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段在搅拌下储存在所述洗出液中。

21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段在不搅拌下储存在所述洗出液中。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段储存在填充至最大50％至70％或60％体积的容器中，任选地其中所述容器被填充至最大60％体积。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段储存12小时至96小时，任选地将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段储存12小时至84小时、24小时至84小时、36小时至72小时、48小时至60小时、24小时至72小时、24小时至60小时、24小时至48小时、24小时至36小时、72小时至84小时、60小时至84小时、48小时至84小时、36小时至84小时、12小时至36小时、24小时至48小时、36小时至60小时、48小时至72小时、或72小时至96小时，任选地其中将包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段储存12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时或96小时。

24.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段在室温下、或2℃至8℃或4℃储存。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中包含一个或多个脱帽半胱氨酸残基的所述抗体或其抗原结合片段在空气覆盖情况下储存。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括纯化所述部分再氧化的抗体或其抗原结合片段。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含在其恒定区上在选自以下的位置用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：所述抗体或其抗原结合片段的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中位置是根据eu系统编号的。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含在其恒定区上在选自以下的位置用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：所述抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199、和203，其中这些位置是根据eu系统编号的，并且其中该轻链是人κ轻链。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含在其恒定区上在以下的位置用半胱氨酸对氨基酸的取代：所述抗体或其抗原结合片段的重链的位置152、位置375、或位置152和375两者，其中所述位置是根据eu系统编号的。

30.生产抗体药物缀合物的方法，，其中所述方法包括将接头-药物部分缀合至通过如权利要求1-29中任一项所述的方法产生的部分再氧化的抗体或其抗原结合片段上，由此生产该抗体药物缀合物。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法进一步包括纯化所述抗体药物缀合物。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述方法产生至少75％，任选地至少80％、85％、90％或95％，位点上偶联，或每条重链一个接头-药物部分(“hc1”)。

33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述方法产生小于25％，任选地至少20％、15％、10％或5％，非位点偶联，或每条轻链一个接头-药物部分(“lc1”)和/或每条重链两个接头-药物部分(“hc2”)。

34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述方法产生至少70％纯度，任选地至少75％、80％、85％、90％或95％纯度，任选地其中所述纯度通过非还原ce-sds确定。