调控多年生黑麦草株型的LpBPM5.6基因、低表达载体、构建方法及其应用

本发明属于植物分子育种，具体涉及一种调控多年生黑麦草株型的lpbpm5.6基因、低表达载体、构建方法及其应用。

背景技术：

1、株型是植物重要的农艺性状，调控分蘖、叶夹角以及根等的基因可通过改善株型的方式显著提高水稻oryza sativa、玉米zea mays、小麦triticum aestivum等作物的产量。与谷物等作物分蘖少、茎叶直立的“理想株型”明显不同，矮株高、多分蘖、茎叶匍匐生长是草坪用草的“理想株型”。

2、黑麦草lolium perenne l.，多年生禾本科植物，根系发达，须根较多，在15厘米～20厘米的土层中呈网状分布，这有助于其更好地吸收土壤中的水分和养分。茎秆直立，中空，丛生，质地柔软，高80厘米-100厘米，具节间，且分蘖较多，这使得黑麦草能够快速地形成茂密的草丛，同时具有分蘖能力强、成坪速度快、绿期长等特点，常用于观赏绿化和高尔夫场球道建植。

3、现有技术中关于调控禾本科植物株型的基因，主要是通过参与植物激素途径，如：与赤霉素生物合成途径相关的dwarf1、dwarf3、dwarf8和dwarf11等；与油菜素内酯生物合成途径相关的brd1、nana plant1和nana plant2等；与生长素生物合成途径相关的breviesplant1和pin1等。这些基因多见于玉米、水稻和小麦中，参与株型的形态建成；而对于调控多年生黑麦草株型的基因，目前尚未有报道。

4、综上所述，急需提供一个调控多年生黑麦草株型的基因，使多年生黑麦草呈现“理想株型”。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种调控多年生黑麦草株型的lpbpm5.6基因、低表达载体、构建方法及其应用，lpbpm5.6的低表达水平使多年生黑麦草呈现出矮株高、多分蘖、少须根的株型，这为草坪草株型改良提供良好应用。

2、本发明所采用的技术方案是，一种调控株型的多年生黑麦草lpbpm5.6基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明提供了一种利用多年生黑麦草lpbpm5.6基因构建的低表达载体，包括以下步骤：

4、提取多年生黑麦草叶片rna，反转录得到cdna；合成一对引物，以cdna为模板，进行pcr扩增，得到attb-pcr产物，引物序列如seq id no.4和seq id no.5所示；将attb-pcr产物与供体载体混合，加入bp重组混合酶孵育，终止，转化至感受态细胞，获得gateway系统的入门载体；将入门载体和表达载体混合，加入lr重组克隆酶孵育，终止，转化至感受态细胞，获得低表达载体。

5、优选地，所述供体载体为pdona207，所述表达载体为pc336。

6、本发明还提供了一种利用多年生黑麦草lpbpm5.6基因或者所述的低表达载体在调控多年生黑麦草株型中的应用。

7、所述低表达载体用于制备低表达lpbpm5.6的多年生黑麦草植株，制备过程包括以下步骤：

8、将所述低表达载体转化进根癌农杆菌感受态细胞，获得阳性重组根癌农杆菌；阳性重组根癌农杆菌侵染多年生黑麦草愈伤组织，在共培养基上黑暗共培养；黑暗共培养的产物转移至抗性培养基，筛选阳性多年生黑麦草愈伤组织；将阳性多年生黑麦草愈伤组织依次转移至分化培养基、壮苗培养基，获得低表达lpbpm5.6的多年生黑麦草植株。

9、优选地，所述根癌农杆菌感受态细胞为eha105、gv3101和lb4404中的任意一种。

10、优选地，所述侵染的过程为：在1.0×105pa～1.5×105pa将多年生黑麦草愈伤组织浸泡在阳性重组根癌农杆菌悬液中20min，随后80rpm～80rpm孵育20min～25min。

11、优选地，所述分化培养基的配方为：每升ms培养基中加入0.5mg～0.6mg苄氨基嘌呤、30g～32g麦芽糖、3g～4g植物凝胶和150mg～152mg特美汀。

12、优选地，所述壮苗培养基的配方为：每升ms培养基中加入30g～32g麦芽糖、3g～4g植物凝胶和150mg～152mg特美汀。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次克隆了一个调控多年生黑麦草株型的基因全长序列，即lpbpm5.6。lpbpm5.6作为一个调控多年生黑麦草株型的基因，可使多年生黑麦草呈现“理想株型”。

14、发明人通过构建lpbpm5.6低表达载体，获得低表达lpbpm5.6基因的黑麦草植株。结果表明，与野生型多年生黑麦草相比，该基因低表达后，可使多年生黑麦草分蘖数增加20％以上，株高和鲜重降低一半以上，并且须根明显减少，这些性状的明显改变为多年生黑麦草等草坪草株型改良提供支撑。

1.一种调控株型的多年生黑麦草lpbpm5.6基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.一种利用权利要求1所述的多年生黑麦草lpbpm5.6基因构建的低表达载体。

3.根据权利要求2所述的低表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的低表达载体构建方法，其特征在于，所述供体载体为pdona207，所述表达载体为pc336。

5.利用权利要求1所述的多年生黑麦草lpbpm5.6基因或者权利要求2所述的低表达载体在调控多年生黑麦草株型中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述低表达载体用于制备低表达lpbpm5.6的多年生黑麦草植株，制备过程包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述根癌农杆菌感受态细胞为eha105、gv3101和lb4404中的任意一种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述侵染的过程为：

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述分化培养基的配方为：