一种多重PCR结合CRISPR-Cas快速检测呼吸道病原体的试剂盒的制作方法

本发明属于呼吸道病原体检测，具体涉及一种联合多重pcr及crispr-cas的快速检测呼吸道病原体核酸的试剂盒及使用该试剂盒的方法。

背景技术：

1、呼吸道病原体，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫，是引起呼吸系统感染的主要原因。这些病原体通过空气传播、接触传播或其他方式进入人体，导致从轻微到严重的呼吸道疾病。近年来，随着新发传染病的出现和传统疾病的复燃，呼吸道病原体的检测技术在公共卫生和临床医学中变得越来越重要。

2、呼吸道病原体引起的疾病不仅影响患者的健康，还对社会经济和公共卫生系统带来巨大的负担。常见的呼吸道病原体包括：

3、细菌：如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌。

4、病毒：如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒(包括sars-cov、mers-cov和sars-cov-2)和副流感病毒。

5、真菌：如曲霉菌、新型隐球菌和念珠菌。

6、这些病原体可以引起一系列呼吸道疾病，从普通感冒、急性支气管炎到严重的肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ards)和肺结核等。儿童、老人和免疫力低下的人群是这些疾病的高危人群。

7、早期、准确的病原体检测对于控制疾病传播和制定治疗方案至关重要。通过准确的病原体检测，可以帮助临床医生制定精准治疗方案：避免滥用抗生素，减少耐药性菌株的产生；可以监测疾病的流行情况：及时发现和控制传染病的爆发，防止大规模流行；可以提高公共卫生应对能力：特别是在面对新发传染病时，快速、准确的检测可以极大地提高公共卫生应对的效率和效果。

8、传统检测呼吸道病原体的方法包括细菌培养、显微镜检查、免疫学方法。

9、细菌培养是传统的病原体检测方法之一。通过在特定培养基上生长细菌，可以鉴定出具体的病原体并进行药敏试验。这种方法虽然准确性高，但耗时较长(通常需24-48小时)，对于一些难以培养的细菌或病毒检测效果有限。

10、显微镜检查可以直接观察病原体的形态，常用于检测细菌和寄生虫。虽然操作简便，但灵敏度和特异性较低，依赖于技术人员的经验。

11、酶联免疫吸试验(elisa)和荧光免疫检测技术通过检测血清中的抗体或抗原来识别病原体。这些方法灵敏度和特异性较高，适用于大规模筛查，但需要较长时间才能得出结果。

12、分子生物学检测技术近年来取得了显著的发展，特别是在基因编辑、疾病和病原体检测和生物医学研究等领域。分子生物学检测技术包括聚合酶链式反应(pcr)、逆转录pcr(rt-pcr)、下一代测序(ngs)等。

13、pcr技术，尤其是实时荧光定量pcr(qpcr)，能够在短时间内高效扩增和检测病原体的核酸。其高灵敏度和特异性使其成为目前最广泛使用的检测技术之一。然而，pcr检测对实验室设备和技术人员的要求较高，成本较高。

14、rt-pcr用于检测rna病毒(如流感病毒和冠状病毒)，通过逆转录将rna转化为dna，再进行pcr扩增。虽然操作步骤复杂，但在rna病毒检测中具有极高的灵敏度和特异性。

15、ngs技术是一种高通量的dna测序技术，能够在短时间内并行测序大量dna片段。与传统的sanger测序相比，ngs技术具有更高的灵敏度和通量，能够对复杂基因组进行全面分析，发现已知和未知的病原体，特别适用于复杂感染和多重病原体检测。但是费用较高，测序设备和试剂费用较高，限制了在资源有限地区的广泛应用；数据分析复杂：需要强大的生物信息学分析能力，处理和解读海量数据；样本处理要求高：需要高质量的样本提取和文库构建，以保证测序结果的准确性。

16、快速检测技术在呼吸道病原体检测中具有重要的应用价值，能够在短时间内提供准确的检测结果，有助于及时诊断和控制疾病传播。几种常见的快速检测技术包括免疫层析试验(immunochromatographic test,ict)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)、核酸序列依赖扩增(nucleicacid sequence-basedamplification,nasba)、crispr/cas系统等。

17、免疫层析试验是一种基于抗原-抗体反应的快速检测技术，通常用于现场快速诊断。ict包括试纸条和卡式装置，通过毛细作用将样本和标记抗体移动到检测区域。具有操作简便、快速、多样性等特点。但灵敏度和特异性相对较低，容易出现假阴性或假阳性结果。

18、环介导等温扩增(lamp)是一种高效、快速的dna扩增技术，能够在恒定温度下(60-65℃)进行扩增反应。lamp技术利用四种特异性引物识别目标dna的六个不同区域，结合链置换dna聚合酶，在短时间内(通常不到1小时)大量扩增目标dna。具有操作简便、速度快，对设备要求较低的优势。但是可能需要针对不同病原体设计特异性引物，应用范围有限。

19、重组酶聚合酶扩增(rpa)是一种在恒定低温(约37-42℃)下进行的核酸扩增技术。rpa利用重组酶、dna聚合酶和单链结合蛋白在恒定温度下进行扩增。具有反应迅速、灵敏度高，可在常温条件下进行，适合现场检测等优势。同样，与lamp类似，需设计特异性引物，且在实际应用中仍需优化。

20、nasba是一种特异性扩增rna分子的技术，常用于病毒rna的检测。nasba在恒定温度下(41℃)进行，利用逆转录酶、rnase h和t7 rna聚合酶，能够将rna逆转录成cdna，并通过rna聚合酶扩增。适用于rna病毒的检测。但也存在复杂的样本处理、rna降解风险、引物设计难度大、定量能力有限、结果解读复杂、设备和试剂依赖性高、成本较高和交叉污染风险等劣势。

21、crispr/cas系统在病原体诊断中通常利用cas蛋白(如cas9、cas12、cas13)的核酸酶活性，结合特异性导向rna(grna或crrna)，识别和切割目标病原体的核酸序列(dna或rna)。两种常用的crispr诊断平台：sherlock(specific high-sensitivity enzymaticreporterunlocking)和detectr(dna endonuclease-targeted crispr trans reporter)

22、sherlock诊断平台，用于rna靶标检测。cas13a在识别到特定rna序列后，触发其rna酶活性，导致周围rna分子(包括报告rna)被切割。通过报告rna的切割产生荧光信号，实现信号放大和可视化检测。

23、detectr诊断平台，用于dna靶标检测。cas12a在识别到特定dna序列后，触发其非特异性单链dna酶活性，切割周围的报告单链dna(ssdna)。通过报告ssdna的切割产生荧光或比色信号，实现信号放大和可视化检测。

24、尽管呼吸道病原体的检测技术已经取得了显著进展，但仍面临一些挑战，需要进一步缩短检测时间，提高检测的准确性和灵敏度；开发能够同时高通量检测多种病原体的技术，以应对复杂感染情况；进一步降低检测成本，提升在资源有限地区的可及性；快速识别和检测新出现的病原体，如新型冠状病毒。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供了一种基于多重pcr及crispr-cas的快速检测呼吸道病原体核酸的试剂盒，该试剂盒能够同时高通量检测178种呼吸道病原体，提高呼吸道病原体的检测灵敏度和特异性。相比于目前的荧光定量pcr和ngs检测技术，本试剂盒可同时大批量检测多种靶标、不需要精密测序仪器，扩增检测产物被crispr-cas蛋白切割，不易产生污染，具有成本低、靶标多、易部署等特点，可用于推广病原体的分子检测，为临床诊断或/和科学研究提供更有效的工具。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种多重pcr结合crispr-cas快速检测呼吸道病原体的试剂盒，所述试剂盒包括多重扩增引物组合、装填sgrna的sgrna检测板、dna聚合酶、rna逆转录酶、crispr/cas蛋白、荧光报告探针；

4、所述多重扩增引物组合为seq no 1～374所示序列；

5、所述sgrna检测板为阵列式微孔板，每个检测孔分别装填有seq no 383～569所示sgrna中的一种。

6、微孔板可以为24孔板、48孔板、96孔板、384孔板等。

7、所述crispr/cas蛋白优选cas12a蛋白。

8、本发明检测的呼吸道病原体为以下178种呼吸道病原体中的一种或多种：

9、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、纹带棒状杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、产气克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、卡他莫拉氏菌、惠普尔养障体、嗜肺军团菌、皮疽诺卡菌、百日咳鲍特菌、副血链球菌、巴西诺卡菌、豚鼠诺卡菌、星型诺卡菌、化脓链球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群、肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、日本立克次氏体、人型支原体、约旦军团菌、辛辛那提军团菌、橡树岭军团菌、沃氏军团菌、耶氏耶肺孢子菌、新型隐球菌、土曲霉、烟曲霉、黄曲霉、热带念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、微小根毛霉、米根霉、马尔尼菲篮状菌、尖端赛多孢子菌、黑曲霉、小孢根霉、灰色小克银汉霉、瓦氏军团菌、疱疹病毒1型、疱疹病毒3型、疱疹病毒4型、疱疹病毒5型、疱疹病毒6型、疱疹病毒7型、人博卡病毒1型、腺病毒b组、腺病毒c组、腺病毒e组、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、副流感病毒3、副流感病毒4、冠状病毒oc43、冠状病毒229e、冠状病毒nl63、冠状病毒hku1、2019新型冠状病毒、人偏肺病毒、鼻病毒a、鼻病毒b、鼻病毒c、肠道病毒a组、肠道病毒b组、肠道病毒c组、肠道病毒d组、呼吸道合胞病毒a、呼吸道合胞病毒b、产酸克雷伯菌、医院不动杆菌、无乳链球菌、胃消化链球菌、人博卡病毒2型、人博卡病毒3型、人博卡病毒4型、灵长目红系细小病毒1、人多瘤病毒1型、人多瘤病毒2型、人多瘤病毒3型、人多瘤病毒4型、人多瘤病毒5型、图森军团菌、副百日咳鲍特菌、汉氏巴尔通体、苍白密螺旋体、脆弱拟杆菌、假结核棒状杆菌、白喉棒状杆菌、害肺戴阿里斯特杆菌、小韦荣氏球菌、克氏柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌群、戈登链球菌、马红球菌、假肺炎链球菌、溶血葡萄球菌、按蚊伊丽莎白菌、新洋葱伯克霍尔德氏菌、坏死梭杆菌、问号钩端螺旋体、血链球菌、支气管败血鲍特菌、杜氏假丝酵母、耳假丝酵母、拟平滑假丝酵母、似平滑假丝酵母、藤仓镰刀菌、禾谷镰刀菌、匍匐犁头霉、中间假丝酵母、塔宾曲霉、杂色曲霉、卷枝毛霉、羊流产衣原体、克柔假丝酵母、沙眼衣原体、解脲脲原体、伯氏考克斯氏体、圣海伦斯军团菌、马赛军团菌、茴香军团菌、菲氏军团菌、伯里亚德军团菌、新苏格兰诺卡菌、武田诺卡菌、微白诺卡菌、鰤鱼诺卡菌、南非诺卡菌、米氏克雷伯氏菌、福赛斯坦纳菌、懒惰狡诈菌、米尔伊丽莎白菌、摩氏摩根菌、拟肺炎克雷伯菌、缺陷乏养菌、乳明串珠菌、牡蛎诺卡菌、荚膜组织胞浆菌、耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌、海分枝杆菌、墨西哥诺卡菌、偶发分枝杆菌、巴黎军团菌、哈氏军团菌、马氏军团菌、长滩军团菌、盖尔森基兴诺卡菌、华氏诺卡菌、亚洲诺卡菌、脓肿诺卡菌、萜烯诺卡菌、寡食诺卡菌、非洲诺卡菌、布氏诺卡菌、北京诺卡菌、凹菌落诺卡菌、新金色分枝杆菌。

10、呼吸道病原体和对应的检测该病原体靶标序列的sgrna如下表所示：

11、

12、

13、

14、

15、

16、

17、进一步，所述的荧光报告探针为一段单链dna，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

18、所述基团包括但不限于fam、hex、vic、cy5、cy3、rox、tamra；所述荧光淬灭基团包括但不限于bhq1、bhq2。

19、所述的单链dna可以被crispr/cas蛋白识别并切割，单链dna可以为线性结构和茎环结构，线性结构可以为cccccc、ttttt等，优选单链dna的序列为cccccc。

20、进一步的，所述试剂盒包括多重扩增体系和检测体系，所述多重扩增体系包括多重扩增引物组合、扩增酶、扩增缓冲液；所述扩增酶包括dna聚合酶、rna逆转录酶；

21、所述检测体系包括装填sgrna的sgrna检测板、crispr/cas蛋白、检测液，所述检测液包括检测缓冲液和荧光报告探针。

22、优选的，所述扩增缓冲液包括pcrbuffer、dntp和mgcl2，优选所述扩增缓冲液包括dntp 0.1～50mm、mgcl21～100mm。pcrbuffer可选用市售pcr扩增缓冲液。

23、扩增酶的浓度一般为聚合酶10～3000u/μl、逆转录酶10～3000u/μl。

24、所述多重扩增体系用于对待测样本进行多重pcr扩增，同时扩增多个目标区域。

25、所述检测缓冲液包括tris-hcl、mgcl2、nacl和dtt(二硫苏糖醇)；优选的所述检测缓冲液包括tris-hcl 5～100mm(ph8～9)，mgcl25～150mm，nacl 5～100mm，dtt 1～50mm。

26、所述检测体系用于对多重pcr扩增的扩增产物进行crispr-cas检测，具体过程是：sgrna将crispr/cas蛋白引导至靶标，识别到靶标后，激活crispr/cas蛋白的反式切割属性，将荧光报告探针的单链dna切割，释放荧光基团发光。

27、crispr/cas蛋白的浓度为0.1～10pmol/μl；

28、荧光报告探针的浓度为0.1～50μm。

29、sgrna的浓度为0.1～10μm。

30、所述试剂盒还可以包括内标和阴性对照。

31、所述阴性对照为102～106cfu/ml人源细胞；

32、所述内标包括第一内标、第二内标、第三内标；

33、所述第一内标为一段1-10pg/μl人工合成dna片段，作为空白dna内标；

34、所述第二内标为一种102～106copies/ml空白rna假病毒，作为空白rna内标；

35、所述第三内标为0.1-100ng/μl人源egfr片段，作为crispr-cas检测内标。

36、较为优选地，第一内标、第二内标的多重扩增引物为seq no 375～382所示序列；具体的，第一内标可扩增三个靶点，引物序列为seq375～578、381、382；第二内标的扩增引物为seq no 379～380所示序列。

37、较为优选的，第一内标、第二内标、第三内标的sgrna的序列为seqno 570～575。

38、具体的，第一内标靶点1的sgrna序列为seq no 570、第一内标靶点2的sgrna序列为seq no 571，第一内标靶点3的sgrna序列为seq no 574；

39、第二内标的sgrna序列为seq no 572、第三内标靶点1的sgrna序列为seqno 573；第三内标靶点2的sgrna序列为seq no 575。

40、所述试剂盒还可以包括核酸提取试剂，用于提取待测样本的核酸作为模板。

41、或者采用市售的核酸提取试剂盒提取待测样本的核酸。

42、本发明还提供所述多重pcr结合crispr-cas快速检测呼吸道病原体的试剂盒在快速检测呼吸道病原体中的应用。

43、进一步，本发明还提供利用多重pcr结合crispr-cas快速检测呼吸道病原体的试剂盒，检测呼吸道病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

44、(1)提取待测样本的核酸作为模板；

45、待测样本通常为呼吸道样本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子、胸水等。

46、优选的，在待测样本中加入第一内标、第二内标后提取核酸，作为模板。

47、(2)以提取的核酸为模板，加入多重扩增引物组合、扩增酶、扩增缓冲液配制得到多重pcr反应体系，进行多重pcr扩增，得到扩增产物；

48、(3)扩增产物、crispr/cas蛋白、检测液加入sgrna检测板中，每个检测孔分别装填有不同病原体对应的sgrna，每个检测孔配制相同的crispr-cas荧光检测反应体系，避光反应，使用荧光检测仪检测荧光信号，进行判定：荧光信号值为14000以上，判定该检测孔对应病原体阳性。

49、所述步骤(2)中，所述多重pcr反应体系优选为50μl，包括扩增缓冲液25μl、扩增酶2μl、多重扩增引物组合13μl、核酸模板5μl、余量为水。

50、所述步骤(2)中，多重pcr扩增的反应程序优选为：

51、①50℃，15min；

52、②95℃，3min；

53、③95℃，15sec；60℃，75sec；72℃，30sec；45个循环。

54、所述步骤(3)中，所述crispr-cas荧光检测反应体系优选50μl，包括检测液5μl、crispr/cas蛋白2.5μl、sgrna 10μl、扩增产物1μl，余量为水。

55、在一个优选的实施方式中，用96孔检测板进行高通量检测时，优选crispr-cas荧光检测反应体系为50μl，包光条件下，37～42℃(优选42℃)反应20～30min。

56、所述步骤(3)中，使用荧光检测仪检测荧光信号，是在同一时间点同时对检测板上的多个检测孔进行检测。

57、检测板的每个检测孔分别装填seq no 383～569所示序列，其中鸟分枝杆菌复合群扩增2个靶标序列，与其互补的两条sgrna，序列如seq id no.415、seq id no.416所示，装填于同一孔中。

58、黄曲霉扩增2个靶标序列，与其互补的两条sgrna，序列如seq id no.431、seq idno.432所示，装填于同一孔中。

59、白色念珠菌扩增2个靶标序列，与其互补的两条sgrna，序列seq id no.434、seqid no.435所示，装填于同一孔中。

60、值得注意的是，对于结核分枝杆菌和新型隐球菌，各扩增2个靶标序列，与其互补2条sgrna，分别装填于2孔中，即有2个靶标。

61、结核分枝杆菌的sgrna分别为seq id no.409、seq id no.410。要求分别装填seqid no.409、seq id no.410所示序列sgrna的两孔检测孔均为阳性，才能判定结核分枝杆菌阳性。如果任意孔为阴性，无法判定为结核分枝杆菌阳性。

62、新型隐球菌的sgrna分别为seq id no.427、seq id no.428。要求分别装填seq idno.427、seq id no.428所示序列sgrna的两孔检测孔均为阳性，才能判定新型隐球菌阳性。如果任意孔为阴性，无法判定为新型隐球菌阳性。

63、在一个优选的实施方式中，每块检测板均要设置一空白对照检测孔，第一内标检测孔、第二内标检测孔和第三内标检测孔。

64、空白对照检测孔中不装填sgrna，只加水作为空白对照。

65、当某一检测板上的sgrna对应的病原体全部为dna病原体时，则可不设第二内标检测孔，仅设空白对照检测孔、第一内标检测孔、第三内标检测孔即可。

66、所述步骤(3)中，判定条件可以进一步细化设定。

67、在一个优选的实施方式中，判定标准对基底值进行了统计平均，并设定标化参数，对数据进行标准化，具体为：

68、①将96孔检测板中含有病原体sgrna检测孔(不含内标、对照孔)的荧光数值按照从小到大的顺序排序，取前60个数值，计算平均值得到nc-av，设定标化系数＝7000/nc-av1(7000为空白对照本底值)，所有孔的数据乘以标化系数，得到标化后的数据(取整数)；

69、②检测孔的荧光值大于14000，判定为阳性，13000<荧光值≤14000判定为灰区，荧光值小于13000判定为阴性。

70、本发明的有益效果在于：

71、1、通过超多重pcr富集技术对呼吸道标本中的靶标核酸进行特异性的扩增，一次可同时扩增多种病原体靶标核酸，检测通量高达178种病原体。

72、2、超多重pcr实现了dna和rna靶标单管扩增，可同时检测病毒和细菌。

73、3、对多重pcr产物，通过crispr-cas，对核酸片段靶点进行特异性识别，激活荧光基团，在激发光作用下形成特定波长的的荧光信号，该荧光信号可被捕捉读取从而得到病原体扩增片段是否存在的信息，实现对病原微生物核酸的定性检测。

74、4、检测手段简单，无需昂贵且精密的荧光定量pcr仪器、测序仪，设备低廉，成本低、适用范围更广泛。

75、5、扩增产物被crispr-cas蛋白切割，不易产生病原体污染。

76、6、本发明方法灵敏度高、特异性高、成本低、时间短、特异性高、灵敏度高等特点，能为临床上诊断病原体的感染提供分子水平的判断依据和帮助。