一种生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株、构建方法和应用

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵，尤其涉及一种生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株、构建方法和应用。

背景技术：

1、樱花素是柑橘黄烷酮柚皮素的7-o-甲基化衍生物，首次是从樱桃树皮中分离出来。研究表明，樱花素具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和免疫调节等作用，已被广泛用于化妆品和制药行业。就化学结构而言，樱花素化学名称为4’-5-二羟基-7-甲氧基黄烷酮，由两个稠环a、c以及一个苯环b组成，苯环b在c-2位连接到c环上。樱花素在植物体内由黄烷酮通用前体柚皮素在柚皮素7-o-甲基转移酶（nomt）的催化下一步合成。在该过程中，由s-腺苷蛋氨酸(sah)作为甲基供体提供甲基部分，以产生相应的樱花素产物。在前体柚皮素过量积累的情况下，增加sam的供应有望提高樱花素的产生，然而在柚皮素利用sam转甲基化合成樱花素过程中，会产生副产物s-腺苷-l-高半胱氨酸(sah)，该副产物的积累会抑制nomt的活性，从而造成樱花素的合成量显著降低。

2、解脂耶氏酵母（ yarrowia lipolytica）是一种非常规酵母，属于半子囊菌类。作为广泛研究的非常规酵母之一，具有较为清晰的理化特征和遗传背景，被认为是一种gras菌株。同时其具有抗逆性强，底物谱丰富，可以利用多种廉价可再生底物作为碳源，胞内产生丰富的前体物质乙酰辅酶a等优良特性，已被开发作为多种精细化学品和天然产物的微生物细胞工厂，产品包括柠檬酸、多不饱和脂肪酸、类异戊二烯化合物等。

3、本领域技术人员应该了解的是，微生物合成代谢通道不止一个，而对于不同的代谢通路进行改善，均会带来无法预期的技术效果。而目前解脂耶氏酵母应用于提升nomt的活性，从而提升樱花素合成量的研究报道较少。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株、构建方法和应用，本发明通过基因工程构建解脂耶氏酵母菌株，该菌株可提升nomt的活性，从而提升樱花素合成量。

2、本发明提供了一种生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株，所述重组解脂耶氏酵母菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组解脂耶氏酵母菌株的ku70基因被osnomt基因替代；

3、所述重组脂耶氏酵母菌株的s-腺苷高半胱氨酸水解酶(sahh)、腺苷激酶(ado)和腺苷脱氨酶(tad)的活性增强。

4、进一步的，所述osnomt基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步的，所述ku70基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、进一步的，所述出发菌株为解脂耶氏酵母po1f mya-2613。

7、进一步的，所述s-腺苷高半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、进一步的，所述腺苷激酶的核苷酸序列如seq id no.7所示。

9、进一步的，所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列如seq id no.8所示。

10、进一步的，所述重组脂耶氏酵母菌株的s-腺苷高半胱氨酸水解酶、腺苷激酶和腺苷脱氨酶的活性增强分别通过过表达下述(a)-(c)所述的基因：

11、(a)由启动子ptef调控的s-腺苷高半胱氨酸水解酶的编码基因；

12、(b)由启动子pexp调控的腺苷激酶的编码基因；

13、(c)由启动子pgpd调控的腺苷脱氨酶的编码基因。

14、进一步的，所述启动子ptef的核苷酸序列如seq id no.3所示。

15、进一步的，所述启动子pexp的核苷酸序列如seq id no.4所示。

16、进一步的，所述启动子pgpd的核苷酸序列如seq id no.5所示。

17、本发明还提供了所述生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，所述构建方法包括：

18、对出发菌株进行遗传改造，将所述出发菌株中ku70基因被替代为osnomt基因获得中间菌株，对中间菌株再进行遗传改造得到s-腺苷高半胱氨酸水解酶、腺苷激酶和腺苷脱氨酶的活性增强的重组解脂耶氏酵母菌株。

19、进一步的，所述出发菌株为解脂耶氏酵母po1f mya-2613。

20、进一步的，所述osnomt基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

21、进一步的，所述ku70基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

22、进一步的，所述中间菌株制备方法为：将携带有ku70基因两端同源臂和osnomt基因的整合表达框线性载体通过醋酸锂法整合至出发菌株的ku70基因所在位点，在敲除出发菌株的ku70基因的同时将osnomt基因整合至菌株中，作为中间菌株。

23、进一步的，所述重组解脂耶氏酵母菌株的制备步骤包括：

24、以制备得到的中间菌株为出发菌株，将中间菌株培养至指数生长期，收集菌体，离心弃上清后，加入ptef-sahh-pexp-ado-pgpd-tad表达框，混匀后在37℃下孵育1h后，涂布尿嘧啶缺陷型固体培养基平板，筛选得到重组解脂耶氏酵母菌株。

25、本发明还提供了所述重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成樱花素中的应用。

26、进一步的，所述发酵合成的发酵培养基包括无氨基酵母氮源2g/l-4g/l、酵母提取物1g/l-3g/l、硫酸铵4g/l-8g/l、葡萄糖40g/l-60g/l、氯化钙0.1g/l-0.3g/l、硫酸钾0.4g/l-0.8g/l、氯化钠0.6g/l-0.8g/l、七水合硫酸亚铁6mg/l-9mg/l、泛酸钙4mg/l-6mg/l、四水合氯化锰2mg/l-5mg/l、二水合钼酸钠0.06mg/l-0.1mg/l、维生素b6 6mg/l-8mg/l、维生素b12 4mg/l-6mg/l、l-亮氨酸0.15g/l-0.2g/l、l-甲硫氨酸0.2g/l-0.4g/l、l-酪氨酸0.08g/l-0.12g/l、l-组氨酸0.02g/l-0.06g/l、柚皮素1g/l-1.8g/l。

27、进一步的，所述发酵培养基的ph为5.6。

28、进一步的，所述发酵培养的条件包括：培养温度26℃-29℃，在170rpm-190rpm下培养23h-25h。

29、进一步的，所述重组解脂耶氏酵母菌株的接种量为发酵培养基体积的1%。

30、本发明实施例具有以下技术效果：

31、1.本发明的重组解脂耶氏酵母菌株过表达内源性的s-腺苷高半胱氨酸水解酶、腺苷激酶和腺苷脱氨酶，该代谢通路能够有效促进樱花素合成过程中副产物s-腺苷-l同型半胱氨酸的水解，有效减少其对nomt的抑制作用，改善基因工程菌株中樱花素的合成。

1.一种生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组解脂耶氏酵母菌株的ku70基因被osnomt基因替代；

2.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述启动子ptef的核苷酸序列如seq id no.3所示；

3.权利要求1-2任一项所述的生产樱花素的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述中间菌株制备方法为：将携带有ku70基因两端同源臂和osnomt基因的整合表达框线性载体通过醋酸锂法整合至出发菌株的ku70基因所在位点，在敲除出发菌株的ku70基因的同时将osnomt基因整合至菌株中，作为中间菌株。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌株的制备步骤包括：

6.权利要求1-2任一项所述的重组解脂耶氏酵母菌株或权利要求3-5任一项所述的构建方法在发酵合成樱花素中的应用，其特征在于，发酵合成的发酵培养基包括无氨基酵母氮源2g/l-4g/l、酵母提取物1g/l-3g/l、硫酸铵4g/l-8g/l、葡萄糖40g/l-60g/l、氯化钙0.1g/l-0.3g/l、硫酸钾0.4g/l-0.8g/l、氯化钠0.6g/l-0.8g/l、七水合硫酸亚铁6mg/l-9mg/l、泛酸钙4mg/l-6mg/l、四水合氯化锰2mg/l-5mg/l、二水合钼酸钠0.06mg/l-0.1mg/l、维生素b6 6mg/l-8mg/l、维生素b12 4mg/l-6mg/l、l-亮氨酸0.15g/l-0.2g/l、l-甲硫氨酸0.2g/l-0.4g/l、l-酪氨酸0.08g/l-0.12g/l、l-组氨酸0.02g/l-0.06g/l、柚皮素1g/l-1.8g/l。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的ph为5.6。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：培养温度26℃-29℃，在170rpm-190rpm下培养23h-25h。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌株的接种量为发酵培养基体积的1%。