使用大规模神经活动确定生物样品对生物模型的影响的体外或离体方法与流程

本发明涉及诊断领域，特别是与作为生物传感器的微流体技术相关的诊断生物感受器领域。因此，本发明涉及一种用于确定生物样品对生物模型的影响的方法、在这样的方法中实施的生物感受器以及所述生物感受器的用途。

背景技术：

1、中枢和/或周围神经系统病理影响着全球7亿多人、欧洲1000多万人、法国数万人。这些病理在病因、发展和治疗方面都被认为是最复杂的。这些神经认知障碍(例如阿尔茨海默病、帕金森病、颅脑创伤、脑血管意外或肌萎缩侧索硬化症)导致受试者的认知、功能和/或行为缺陷，即与语言、社交互动、记忆、逻辑推理或自主性相关的能力的改变。因此，这些病理，也称为神经学疾病或神经疾病，构成了重大的公共健康问题。

2、目前，这些疾病的诊断基本上是在出现和观察到最初症状后进行的。在最初临床诊断之后，进行血液或脑脊液(csf)等生物流体的化验，并补充有成像测试。关于其他神经元病症，例如颅脑创伤(或脑震荡)，诊断是基于格拉斯哥评分的建立，该评分是通过临床观察和症状建立的。

3、近年来，已经证明了允许诊断这些神经学疾病或神经疾病的新型生物标志物的存在。例如，存在于lcs或血液等生物流体中的microrna允许通过非常常规的生物测定技术(如聚合酶链式扩增(或聚合酶链式反应或pcr)或固体支持物上的免疫酶技术(或酶联免疫吸附试验或elisa)来诊断脑震荡。

4、目前的治疗是在二级和三级伴随和预防方法的背景下进行的，旨在通过预测疾病的晚期来维持生活质量、预防并发症和行为性发作。此外，建立可靠的鉴别诊断的复杂性使得寻找新的治疗方法变得困难。事实上，对于几种不同的损伤，例如神经退行性疾病，可能有相同或相似的临床症状，因为这些病症涉及相同的功能障碍蛋白。

5、因此，为了确保疾病的有效和最早的管理，有必要建立这样的神经学疾病或神经疾病的可靠和早期诊断，从而能够改进合适的治疗的确定。

6、然而，迄今为止，尚无灵敏、快速且可重复的测试能够对与神经学疾病和/或神经疾病相关的认知、功能和/或行为缺陷进行早期和确定性诊断。

7、同时，用于测定试剂(例如药物)对神经活动活性的方法通常基于活体动物的行为改变或使用组织生物传感器。然而，这种类型的动物模型行为测试成本高昂、耗时长、难以量化且几乎不可重复。

8、基于组织的生物传感器的使用克服了行为测试施加的一些限制，并且提供了更容易量化的结果。然而，这样的生物传感器的灵敏度有限，不能检测认知功能的细微改变。能够检测改变或以其他方式修改神经功能的试剂的组织生物传感器通常由保持在电极网络上的培养的神经元组成，所述电极网络记录细胞膜的被动性质，如输入阻抗或自发性动作电位的活动。由于灵敏度低，这些类型的生物传感器主要用于确定由于暴露于高浓度的毒剂而导致的急性细胞死亡(例如，突触槽中高浓度的谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性)。此外，大多数生物传感器仅提供短期数据。

9、总体而言，传统的解决方案具有以下缺点：/)它们不允许或几乎不允许检测可能在神经学疾病和/或神经疾病的起源或指示神经学疾病和/或神经疾病存在的未知的或新的试剂的存在；/)它们主要检测快速作用试剂的影响，而需要几小时或几天才能产生影响的试剂通常无法用已知方法检测到；以及///)它们不能区分受影响的神经集群。

10、基于上述内容，显然需要开发新的解决方案，能够快速、有效、早期和可靠地对神经学疾病和/或神经疾病进行鉴别诊断。

技术实现思路

1、本发明人出乎意料且令人惊讶地开发了一种用于确定生物样品对涉及神经网络的生物模型的影响的方法。该方法通过创新的生物传感器来实施，该生物传感器尤其包括生物感受器，该生物感受器有利地包括多隔室微流体装置的形式。该方法，包括用于确定生物样品对生物模型的影响的生物感受器及其用途，在本说明书全文中都有描述。

2、本发明的目的是获取暴露于生物样品的神经网络状态的数据，然后分析这些数据，以便快速且更低成本地建立对受试者的神经学疾病和/或神经疾病的鉴别诊断，提高了特异性/敏感性比率。总之，目的是提供适合受试者的治疗，旨在保持生活质量，预防并发症并预测病理发展，特别是向病理晚期发展。

3、因此，本发明涉及一种用于确定生物样品对生物模型的影响的体外或离体方法，包括以下步骤：

4、a.提供生物感受器，该生物感受器有利地包括多隔室微流体装置的形式，该多隔室微流体装置包括:

5、i)至少第一隔室和第二隔室；

6、ii)至少一个形成生物接口(biological interface)的装置，用于实现通过第一隔室和第二隔室之间的神经连接的通讯；

7、iii)每个隔室培养至少一种类型的细胞或外植块(explant)，第一隔室至少包括神经网络形式的神经元培养物，第二隔室至少包括神经网络形式的神经元培养物和/或非神经元细胞培养物或外植块培养物；

8、iv)至少一个实现在第一隔室中空间分布的多个测量点上记录神经元的功能活动的装置；

9、b.将第二隔室中培养的神经元和/或非神经元细胞或外植块与所述生物样品直接或间接接触；

10、c.在根据步骤b)所述的接触之后的测量持续时间内，在多个测量点上记录第一隔室中培养的神经元的功能活动；

11、d.将第一隔室中培养的神经元的功能活动记录转换为功能活动数据；

12、e.分析在步骤d)中获得的功能活动数据；

13、f.由功能活动数据确定第一隔室中神经网络状态的至少一个特征参数；

14、g.比较神经网络状态的至少一个特征参数和神经网络状态的至少一个特征参数的参考值以确定所述生物样品的影响。

15、在本公开的其余部分中，为了简单起见：

16、-术语“神经元”与“神经细胞”等同使用；

17、-术语“神经学和/或神经损伤”与“中枢和/或周围神经系统病理”或“神经认知损伤”或“认知、功能和/或行为缺陷”等同使用；和

18、-术语“损伤”与“病理”、“发病(attainment)”或“损害”等同使用。

19、在本发明的上下文中，“生物模型”应理解为在多隔室微流体结构中单独或共培养源自原代多能或人类干细胞的非人类、人类细胞的培养物、与其天然生物环境分离的神经元或非神经元结构，其中隔室直接或间接连接。换句话说，这包括在对自然条件或体内条件改变最小的人工环境中培养细胞。

20、在本发明的上下文中，“生物接口”应理解为一种系统，其包括本发明装置中所含的细胞群之间的接触连接，能够通过电和/或化学通讯交换信息来实现细胞的通讯。在本发明的含义内，这可以由神经元细胞、非神经元细胞或组织外植块的培养物组成。

21、在本发明的上下文中，“生物感受器”应理解为能够选择性识别分子(或分析物)的一组分子和/或细胞。例如，可以提及酶、细胞、适体、纳米颗粒或抗体。在本发明的含义内，生物感受器是神经元的培养物，例如源自多能干细胞的人类神经元，其包含在多隔室微流体装置中，该装置建模了可能是神经学病理和/或神经病理的特征的网络结构。该生物感受器与转换器相关联，该转换器将分析物和生物感受器的联系转换为可测量的信号。根据本发明，该生物感受器和转换器的组合被定义为生物传感器，其优点在于建立快速且可靠的诊断，特别是由于这些微流体结构中存在生物接口，这使得生物感受器更加生理化，即，它由创新的实验模型组成，该模型的物理、生化和生物组织、操作和反应允许将获得的结果转移到人类上。在本发明的上下文中，“生物传感器”应理解为一种装置，其包括至少一个如前定义的生物感受器和如后文所述的将神经元的功能活动转换为功能活动数据的装置。

22、在本发明的上下文中，“神经元的功能活动”应理解为电信号和/或神经递质分泌物形式的神经信息的发射和传播。

23、在本发明的上下文中，“将神经元的功能活动转换为功能活动数据的装置”应该理解为转换器。传感器可分为三大类：光学(例如光纤)、电化学(例如电流、电位、阻抗或电导)以及基于质量(例如压电和磁致弹性)的转换器。

24、在本发明的上下文中，“节点”、“节点连接”或“顶点/边”应理解为以连续方式连接并具有功能活动的神经元、细胞集合或神经元集群的集合。应当注意，大脑包括约1000亿个神经元，1个神经元可以建立多达10,000个连接。

25、在本发明的上下文中，“模块”应理解为连接在一起形成组或“群集”的多个节点。

26、在本发明的上下文中，“动作电位”或“尖峰”应理解为神经流入的出现，即质膜的短暂和局部去极化，然后内膜的再极化(随后可能是无髓鞘细胞的超极化)的连续。

27、在本发明的上下文中，“突发脉冲”应理解为给定时间段内的几个动作电位。突发脉冲通常定义为在规定时间段内(例如100ms)连续的至少四个动作电位。对于这样的持续时间，突发脉冲通常包含10至100,000个尖峰。

28、在本发明的上下文中，“网络突发脉冲”应理解为形成网络的动作电位的组，即根据限定的同步出现。换句话说，网络突发脉冲是由几个电极的同步动作电位检测的。

29、优选地，本发明涉及一种用于确定生物样品对生物模型的影响的体外或离体方法，如前所述，其具有以下单独或组合考虑的技术特征：

30、-第一隔室中神经网络状态的至少一个特征参数选自由以下组成的组：动作电位的数量、动作电位间间隔或“isi”、动作电位间间隔的变异系数、活动电极的数量、标准化动作电位的平均速率、突发脉冲的数量、已捕获一个或几个突发脉冲的电极的数量、突发脉冲的平均持续时间、突发脉冲中动作电位的平均值(isi)、突发脉冲中动作电位间间隔的平均值、突发脉冲间间隔或“ibi”、突发脉冲的频率、突发脉冲的百分比、网络突发脉冲的数量、网络突发脉冲频率、网络突发脉冲持续时间、网络突发脉冲中动作电位的平均值、网络突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值、参与形成网络突发脉冲的电极数量、网络突发脉冲中的突发脉冲百分比、网络突发脉冲中的突发脉冲间间隔(ibi)变异系数、互相关曲线(cross-correlation curve)下的表面积和同步指数，

31、-第一隔室中神经网络状态的至少一个特征参数选自由以下组成的组：

32、i)连接系数；

33、ii)节点间最小长度的平均值；

34、iii)每秒动作电位的平均值；

35、iv)网络连通性指数或“小世界指数”；

36、v)z分数或“z-分数”；

37、vi)参与系数或“参与系数”；和

38、vii)节点的中心性指数，

39、-生物接口包括，有利地由选自以下组中的至少一种元素组成：流体微通道；pdms微通道；多孔膜，其孔隙度有利地包含在10nm至40μm之间，并且其孔密度有利地包含在10至1.109个孔/cm2之间，有利地在1.105至1.109个孔/cm2之间；多孔毛细管膜，有利地由在膜上培养至少一种类器官的膜组成(即，体外再现器官显微解剖学结构的三维多细胞结构)，所述膜由聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚四氟乙烯制成；凝胶；水凝胶及其混合物；

40、-构建表示步骤e)中的神经网络的图，该图是通过实施图论获得的；有利地，图中的节点对应于功能活动的测量点，节点之间的连接对应于轴突通讯的相关性；

41、-步骤f)包括由功能活动数据确定第一隔室中神经网络状态的两个参数、有利地三个参数、四个参数、优选五个参数、六个参数，甚至七个特征参数，所述参数选自由以下组成的组：

42、i)连接系数；

43、ii)节点间最小长度的平均值；

44、iii)每秒动作电位的平均值；

45、iv)网络连通性指数或“小世界指数”；

46、v)z分数或“z-分数”；

47、vi)参与系数或“参与系数”；和

48、vii)节点的中心性指数；

49、-网络的连通性指数是连接系数和节点间最小长度的平均值之间的比率；

50、-每秒动作电位的平均值应该大于或等于0.5、有利地严格大于0.5、优选1或1.5，甚至2，以便能够分析至少一个选自由以下组成的组的参数：

51、i)连接系数；

52、ii)节点间最小长度的平均值；

53、iv)网络连通性指数或“小世界指数”；

54、v)z分数或“z-分数”；

55、vi)参与系数或“参与系数”；和

56、vii)节点的中心性指数；

57、-连接系数的值大于或等于0，优选0.5，有利地包含在0至1之间；

58、-节点间最小长度的平均值大于或等于1，优选1.5或2；

59、-节点间网络的连通性指数的值大于或等于0，优选0.5，有利地包含在0至1之间；

60、-z分数或“z-分数”的值大于或等于0，优选5，有利地包含在0至10之间；

61、-参与系数或“参与系数”的值大于或等于0，优选0.5，有利地包含在0.5至1之间；

62、-节点的中心性指数的值大于或等于0，优选5，有利地包含在6至10之间；

63、-允许根据步骤a.iv)所述的在第一隔室中空间分布、优选在第一隔室和至少一个附加隔室中空间分布、有利地在所有隔室中空间分布的多个测量点上记录神经元的功能活性的装置，该装置是能够与培养的细胞间接接触记录的装置，选自由以下组成的组：

64、-通过平面或非平面微电极阵列、半固体电极、电流法或伏安法记录活动的装置；

65、-荧光成像记录装置，例如钙成像或跨膜离子流成像；和

66、-用于记录全细胞、贴附细胞、内侧向外或外侧向外配置的细胞内、细胞外或膜片钳电生理活动的装置；

67、-将第一隔室中培养的神经元的功能活动记录转换为功能活动数据的步骤d)是通过将神经元的功能活动转换为功能活动数据的装置进行的，该装置是用于将电和/或电生理数据转换为二进制数据的算法系统；

68、-根据步骤c)所述对第一隔室中培养的神经元的功能活动记录的测量持续时间为300ms至20min之间，有利地为1min至15min之间，优选5min至12min之间；

69、-多隔室微流体装置还包括第三隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第三隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第三隔室之间的神经连接地通讯；有利地，第四隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第四隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第四隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第三隔室和第四隔室之间的神经连接地通讯；优选地，第五隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第三隔室和第五隔室之间的神经连接地通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第四隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯；

70、-根据步骤b)所述的接触是间接的，因为生物样品被施加到第二隔室的生物接口上和/或第三隔室的至少一个生物接口上和/或第四隔室的至少一个生物接口上和/或第五隔室的至少一个生物接口上；

71、-本发明的装置中包括的每个隔室包含一种、两种或者甚至三种类型的神经元和/或非神经元细胞的培养物；

72、-神经元选自由以下组成的组：谷氨酸能神经元、gaba能神经元、血清素能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、感觉神经元和运动神经元；

73、-非神经元细胞选自由以下组成的组：神经胶质细胞(包括小胶质细胞/巨噬细胞和大胶质细胞(即少突胶质细胞、施万细胞和室管膜细胞))、上皮细胞、结膜(conjunctive)细胞、甲状腺细胞、脂肪细胞、血液细胞、免疫细胞、骨细胞、软骨细胞、胃细胞、胰腺细胞、肝细胞、肠细胞或肺细胞、内皮细胞、肌肉细胞、血管细胞、心脏细胞、间充质细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜细胞；

74、-外植块是脑组织、上皮组织、眼组织、甲状腺组织、脂肪组织、血管组织、骨组织、软骨组织、胃组织、胰腺组织、肝组织、肠组织、肺组织、内皮组织、肌肉组织和视网膜起源的组织、心脏组织和胎盘组织；和/或

75、-生物样品选自由以下组成的组：血液、唾液、尿液、泪液、汗液、痰、粘液、脓、淋巴液、脑脊液、鼻咽分泌物、口咽分泌物、滑液、胸膜液、腹膜液、心包液、房水、羊水和血浆；和/或

76、-生物样品可以是“试剂”或“检测试剂”，即具有神经元功能活动调节特性的化合物或我们不知道它是否具有神经元功能活动调节特性的试剂，在这种情况下，本发明的方法允许鉴定和/或表征所述试剂的可能特性，甚至鉴定“阈值浓度”。换句话说，特别是当检测试剂是药物时，这是最小治疗方案下(即对于药物组合物，在通常为动物或人开出的最低治疗剂量下)的试剂浓度。在本发明的实施方案中，在步骤g)中进行的与参考值的比较包括将由在施用试剂或检测试剂之前获得的值组成的本发明的神经网络状态的至少一个特征参数与施用试剂或检测试剂之后获得的值进行比较，所述值在时间上更早以确保监测所述试剂或检测试剂的效果。

77、因此，在本发明的上下文中：

78、-“动作电位的数量”，应理解为记录期间检测到的动作电位的数量(记录上游定义的检测参数)；

79、-“动作电位间间隔”或“isi”，应理解为检测到的动作电位之间的平均持续时间；

80、-“动作电位间间隔的变异系数”，应理解为isi的标准差除以isi的平均值。该参数与动作电位的规律性有关，并反映其分布；

81、-“活动电极的数量”，应理解为具有大于或等于记录前定义的动作电位的最小平均速率的活动的电极数量，

82、-“标准化动作电位的平均速率”，应理解为动作电位的数量除以记录时间(平均值)。该参数通常以hz或尖峰/s(动作电位/秒)为单位定义。该参数仅由记录前定义的活动电极上测量的功能活动数据确定；

83、-“突发脉冲的数量”，应理解为每个电极记录中的突发脉冲的数量或总数(所有电极的突发脉冲的总和)，

84、-“已捕获突发脉冲的电极的数量”，应理解为已测量突发脉冲的数量/分钟的电极的总数量。该突发脉冲的数量/分钟可以在记录之前定义。例如，这可以包括至少5个突发脉冲/分钟；

85、-“突发脉冲的平均持续时间”，应理解为定义每个测量的突发脉冲的第一个和最后一个动作电位之间的平均时间；

86、-“突发脉冲中动作电位的平均值”或“突发脉冲中尖峰的平均值”，应理解为测量的突发脉冲的动作电位的平均数量；

87、-“突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值”，应理解为突发脉冲中定义的动作电位间间隔的平均值；

88、-“突发脉冲间间隔”或“ibi”，应理解为记录的不同突发脉冲之间的平均持续时间；

89、-“突发脉冲的频率”，应理解为突发脉冲的总数量除以记录时间。该参数通常以赫兹或突发脉冲/min为单位定义；

90、-“突发脉冲的百分比”，应理解为突发脉冲中动作电位的数量与记录的动作电位的总数量之间的比率；

91、-“网络突发脉冲的数量”，应理解为记录过程中识别的网络突发脉冲的总数量；

92、-“网络突发脉冲频率”，应理解为网络突发脉冲的总数量除以记录时间。该参数通常以赫兹为单位定义；

93、-“网络突发脉冲持续时间”，应理解为网络突发脉冲中两个动作电位之间的平均时间；

94、-“突发脉冲网络中动作电位的平均值”，应理解为在所有记录的突发脉冲网络中检测到的动作电位的平均值；

95、-“网络突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值”，应理解为在所有记录的网络突发脉冲中定义的动作电位间间隔的平均值；

96、-“参与形成网络突发脉冲的电极数量”，应理解为网络突发脉冲中活动电极的平均数量；

97、-“网络突发脉冲中的突发脉冲百分比”，应理解为网络突发脉冲中动作电位的数量与记录的动作电位的总数量之间的比率；

98、-“网络突发脉冲中的突发脉冲间间隔(ibl)的变异系数”，应理解为ibi的标准差除以ibi的平均值；

99、-“互相关曲线下的表面积”，应理解为电极之间互相关曲线下的表面积。该参数可以根据halliday、rosenber、breeze和conway 2006年在其出版物“neural spike trainsynchronization indices:definitions,interpretations,and applications”中定义的方法确定；

100、-“同步指数”，应该理解为包含在0至1之间的同步度量(没有单位)。该参数可以根据出版物“a comparison of binless spike train measures”(paiva et al.,2010)来确定；

101、-“连接系数”或“聚类系数”，应理解为两个节点在已知它们具有共同邻居的情况下连接的概率；

102、-“节点间最小长度的平均值”，应理解为两个连接的节点之间的长度的平均值；和

103、-“每秒动作电位的平均值”，应理解为每秒神经流入数量的平均值，即质膜的短暂和局部去极化，然后内膜的再极化(可能随后是无髓鞘细胞的超极化)的连续；

104、-“网络的连通性指数”或“小世界指数”，应理解为两个或多个节点之间的结构连接(物理连接，即突触和轴突)和生理连接(功能连接/对称关系和有效连接/因果关系)，这是神经网络鲁棒性的反映。优选地，网络的连通性指数由连接系数和节点间最小长度的平均值之间的比率来确定；

105、-z分数或“z-分数”，应理解为一种测量方法，其允许表征节点的连通性在模块中的分布方式，也就是对模块内表征；

106、-参与系数或“参与系数”，应理解为一种测量方法，其允许表征节点的连通性在几个模块之间(即模块间)的分布方式；和

107、-“节点的中心性指数”，应理解为，随机地沿着从节点开始的连接之一，与该节点在图上的随机过程期间通过的次数成比例的值，该图代表根据本发明所述的神经网络。

108、由记录的功能活动数据确定的第一隔室中神经网络状态的这些特征参数可以单独使用或组合使用。它们分为以下四类：

109、1/尖峰(动作电位)分析。该类别包括以下参数：动作电位的数量、每秒动作电位的平均值、动作电位间间隔或“isi”、动作电位间间隔的变异系数、活动电极的数量、标准化动作电位的平均速率；

110、2/突发脉冲分析。该类别包括以下参数：突发脉冲的数量、已捕获一个或几个突发脉冲的电极的数量、突发脉冲中动作电位的平均突发脉冲的平均持续时间、突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值、突发脉冲间间隔或“ibi”、突发脉冲的频率和突发脉冲的百分比。

111、3/网络突发脉冲分析。该类别包括以下参数：网络突发脉冲数量、网络突发脉冲频率、网络突发脉冲持续时间、网络突发脉冲中动作电位的平均值、网络突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值、参与形成网络突发脉冲的电极数量、网络突发脉冲中突发脉冲的百分比、网络突发脉冲中的突发脉冲间间隔(ibi)的变异系数。

112、4/网络连通性。这后一类适用于任何类型的网络，包括神经网络。它包括以下参数，其中一些是使用所谓的互相关的连通性算法确定的(参见“total spikingprobability edges:a cross-correlation based method for effective connectivityestimation of cortical spiking neurons”deblasi et al.,2019)：互相关曲线下的表面积、同步指数、连接系数、节点间最小长度的平均值、网络的连通性指数或“小世界指数”、参与系数或“参与系数”和节点的中心性指数。

113、特别地，根据步骤a.iv)所述的允许在第一隔室中空间分布的多个测量点上记录神经元的功能活动的装置包括与神经元直接或间接接触的电极。该装置允许记录神经元的极化差异，该极化差异允许通过以高于1μv的电位差为特征的动作电位来彼此通讯。

114、根据本发明步骤a.iv)所述的用于将功能活动转换为功能活动数据的装置是用于将电和/或电生理数据转换为二进制数据的算法系统。具体而言，这包括：

115、i)通过提供有记录设备的信号转换器转换电生理数据，所述转换器可以与信号放大器耦合；

116、ii)建立检测阈值以对每个节点单独或集体的神经元的电生理活动进行二值化；

117、iii)基于上一步中获得的数据，所谓的矩阵(matrix)数据，创建节点功能活动的时空矩阵；和

118、iv)创建表示连接到其他节点的每个节点的活动的跨时间和加权时空相关性的图，以在病理表现配置中提供一组定量数据(或矩阵数据)，其被证明是根据本发明所述的每个生物模型的特性。特别地，这在于生成“功能活动特征”，其将与“功能活动特征参考库”或“相同的先前记录的网络的功能活动特征”或“相同的先前记录的网络的功能活动集合”进行比较，从而允许建立记录的特征和参考特征之间的相对差异。

119、在本发明的上下文中，“功能活动特征”应被理解为活动特性，即在根据本发明所述的装置的第一隔室中以网络形式的培养物中的神经元的功能活动(即电活动)的可能改变。

120、在本发明的上下文中，“功能活性特征库”应被理解为多个生物样品(例如2个或更多个、有利地多于10个、优选多于100个、多于1000个，或多于10000个，或甚至多于100000个生物样品)的不同活性特征的集合，这些特征可以彼此识别。

121、在本发明的上下文中，在步骤g)中进行的与参考值的比较在于比较由从预先制备的样品获得的值组成的本发明的神经网络状态的至少一个特征参数(就秒、分钟、小时、天、月和/或年而言)与施用样品后获得的神经网络状态的至少一个特征参数，施用该样品的影响通过本发明的方法；和/或由源自参考库或参考集合的值组成的至少一个特征参数。特别地，

122、-在实施用于确定生物样品对生物模型的影响的体外或离体方法以确保监测受试者的状态的情况下(即监测病理的向上或向下发展(特别是神经学疾病和/或神经疾病的发展)、病理的显现(特别是神经学疾病和/或神经疾病的显现)或通过施用试剂/检测试剂的治疗效果)，然后，用进展标准(evolution criterion)(在有利地包括30秒至60min之间、有利地1min至50min之间、2min至40min之间、3min至30min之间、甚至4min至20min之间、优选5min和10min之间的分析期间的上阈值或下阈值，特别是具有标准差，使用导数)随时间监测神经网络状态的至少一个特征参数的值；

123、-在将神经网络状态的至少一个特征参数与现有的功能活性库进行比较的情况下，应该考虑所有记录的参数i)至vii),这尤其允许获得更可靠的鉴别诊断，即，在不同的可能诊断之间进行区分，对于这些不同的可能诊断，可能有相同或相似的临床症状，因为这些病症涉及相同的功能障碍蛋白。在这种情况下，根据本发明所述的比较步骤包括、优选由以下组成：与其他所谓的“真阳性”和/或“真阴性”受试者的绝对比较，形成参考受试者/数据的组或“群集”；或

124、-步骤f)中进行的与参考值的比较还可以包括与库的绝对比较和如前所述的对受试者状态的监测。

125、例如，在确定是否存在sars-cov-2或covid-19感染的情况下，本发明方法的步骤f)包括由针对功能活动库的绝对比较、有利地由针对功能活动库的绝对比较组成。

126、例如，在建立阿尔茨海默病和帕金森病的鉴别诊断的情况下，本发明方法的步骤g)包括由针对功能活动库的绝对比较、有利地由针对功能活动库的绝对比较组成。之后，为了监测损伤的发展，用进展标准(具有标准差的平均时间段中的上阈值或下阈值，使用导数)对网络的连通性指数(参数iv)的值随时间有利地进行监测。

127、例如，在确定是否存在头部创伤的情况下，本发明方法的步骤g)包括以下、有利地由以下组成：通过用进展标准(具有标准差的平均时间段中的上阈值或下阈值，使用导数)随时间监测网络的连通性指数(参数iv)的值，来监测损伤的发展。

128、例如，用于将功能活动转换为功能活动数据的装置是用于将电和/或电生理数据转换为二进制数据的算法系统。

129、根据本发明，可以包括将由mea2100-headstage系统(多通道系统，德国罗伊特林根)记录的功能活动信号通过模数变换器转换为数字信号，该模数变换器可能耦合到放大器或放大器组，所述变换器直接集成到记录设备中。该数据流二进制信号由与设备一起提供的软件mea2100-256-systems(多通道系统，德国罗伊特林根)读取。或者，还可以包括将由m768tmea-16(axion biosystems，美国佐治亚州亚特兰大)系统记录的功能活动信号通过模数变换器转换为数字信号，该模数变换器可能耦合到放大器或放大器组，所述变换器直接集成到记录设备中。该二进制数据流信号由与设备一起提供的axis navigator(axionbiosystems，美国佐治亚州亚特兰大)软件读取。

130、例如，将节点的数字活动转换为节点的二进制信号的装置由本领域技术人员公知的阈值算法来确保，该算法包括分析信号的背景噪声并应用合适的滤波器以便对整个信号应用二值化阈值。

131、本发明的方法允许将源自受试者的生物样品(例如脑脊液、血液、唾液粘液或检测试剂的样品)应用于生物感受器中，该生物感受器有利地包括多隔室微流体装置的形式，该装置整合了相关的细胞共培养物(神经元和/或非神经元和/或外植块细胞)。优选地，将样品间接地应用于神经元培养物，即，不是在神经元培养物上施用，而是在至少一种相关的共培养物上施用，然后该共培养物通过连接到神经元培养物的生物接口起作用，神经元通过轴突和/或突触延伸，例如在本发明的多隔室微流体装置的微通道中。随后，记录并分析在施用所述生物样品后神经网络的响应，即神经网络功能活动的可能的改变。

132、具体而言，所述神经网络功能活动的改变可通过本领域技术人员已知的任何方式进行，特别是通过：

133、-功能性通讯的改变，即细胞间通讯的效率的改变，其中一个或几个神经元激活与其突触或非突触连接的目标神经元的能力增加、减少或破坏；

134、-轴突和/或树突连接网络的改变，例如通过破坏所述轴突和/或树突；

135、-一种或几种细胞类型的改变，损害神经元通讯，例如干扰仅在节点内的神经胶质细胞，和/或

136、-动作电位的改变，即增加或减少振幅、频率、持续时间、“阈值”电位，使膜能够去极化和/或动作电位能够节律变化。

137、这些改变然后会导致从由以下组成的组中选择的至少一个参数的改变：i)连接系数；ii)节点间最小长度的平均值；iii)每秒动作电位的平均值；iv)网络连通性指数；v)z分数；vi)参与系数；和vii)节点的中心性指数。由此获得由所述参数的相关性得出的功能活动特征，该特征是或不是病理状态的特性。最后，通过将由此获得的功能活动特征与所谓的“真阳性”功能活动特征进行比较来进行诊断，即，其网络标记为真阳性。

138、在鉴别诊断中实施本发明的方法的结果允许通过神经网络的功能分析在少于72小时内、有利地在少于48小时内、优选地在少于24小时内、或在少于12小时、6小时、3小时、2小时、1小时内、或在少于30分钟、20分钟、15分钟或少于10分钟内甚至立即获得结果。

139、由上述可见，本发明的创新之处在于使用网络标记作为诊断标记，识别相关的神经-细胞-外植块结构(即神经元或非神经元或组织的外植块细胞)以建立给定的诊断，以及通过诊断类型量化网络标记以确认诊断。

140、本发明的方法的优点之一是允许建立可靠的鉴别诊断，即，允许将神经学病理和/或神经病理与具有相近或相似症状的另一种病理区分开来，或与在初级临床听诊期间几乎没有或没有可观察到的症状的病理区分开来的诊断。

141、本发明的方法的另一个优点是可以确保快速的鉴别诊断。

142、此外，本发明的方法允许提高特异性/敏感性比率。事实上，与传统的分子的偶联(例如elisa)或pcr扩增的极限相比，本发明的方法具有更好的检测分辨率；由于使用了神经元和至少一种相关的共培养物，从而允许对用于诊断给定病理的特定细胞和分子结构进行建模，确保了特异性。

143、此外，本发明的方法成本低廉，因为不需要使用特定的机器，例如elisa测定、免疫特异性标记、pcr或其他生化测定技术。

144、最后，本发明的方法限制不多，并且根据采样介入的模式，可能几乎不具侵入性，因为它需要使用非常小的流体体积，优选在微升范围内，考虑到微流体装置的实施。

145、本发明还涉及生物感受器，以及包括所述生物感受器的生物传感器，在适当的情况下，来确定生物样品对生物模型的影响。具体而言，它由能够在如前所述的本发明的方法中实施的生物感受器组成。

146、因此，本发明涉及生物感受器，以及包括所述生物感受器的生物传感器，在适当的情况下，用于确定生物样品对生物模型的影响，生物感受器有利地包括多隔室微流体装置的形式，该多隔室微流体装置包括：

147、i)至少第一隔室和第二隔室；

148、ii)至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第二隔室之间的神经连接的通讯(图1)；

149、iii)每个隔室培养至少一种类型的细胞或外植块，第一隔室至少包含神经网络形式的神经元培养物，第二隔室至少包含神经网络形式的神经元培养物和/或非神经元细胞培养物或外植块培养物，所述生物样品可以施加到第二隔室上；

150、iv)至少一个能够在第一隔室中空间分布的多个测量点上记录神经元的功能活动的装置，该装置可以与将功能活动转换为数据的装置结合。

151、优选地，本发明涉及一种生物感受器，以及包在适当的情况下括所述生物感受器的生物传感器，所述生物感受器用于确定生物样品对如前所述的生物模型的影响，具有以下单独或组合的技术特征：

152、-生物接口包括，有利地由选自以下组中的至少一种元素组成：流体微通道；pdms微通道；多孔膜，其孔隙度有利地包含在10nm至40μm之间，并且其孔密度有利地包含在10至1.109个孔/cm2之间，有利地在1.105至1.109个孔/cm2之间；多孔毛细管膜，有利地由在膜上培养至少一种类器官的膜组成(即，体外再现器官显微解剖学结构的三维多细胞结构)，所述膜由聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚四氟乙烯制成；凝胶；水凝胶及其混合物；

153、-它还包括一种用于将第一隔室中培养的神经元的功能活动记录转换为功能活动数据的装置；

154、-它还包括分析装置，被安排为由功能活动数据确定第一隔室中神经网络状态的至少一个特征参数，所述至少一个参数选自由以下组成的组：

155、i)连接系数；

156、ii)节点间最小长度的平均值；

157、iii)每秒动作电位的平均值；和

158、iv)网络连通性指数或“小世界指数”；

159、v)z分数或“z-分数”；

160、vi)参与系数或“参与系数”；

161、vii)节点的中心性指数；

162、-它还包括分析装置，该分析装置被布置为由功能活动数据确定第一隔室中神经网络状态的至少一个特征参数，所述至少一个参数选自由以下组成的组：动作电位的数量、动作电位间间隔或“isi”、动作电位间间隔的变异系数、活动电极的数量、标准化动作电位的平均速率、突发脉冲的数量、已经捕获一个或几个突发脉冲的电极的数量、突发脉冲的平均持续时间、突发脉冲中动作电位的平均值、突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值、突发脉冲间间隔或“ibi”、突发脉冲的频率、突发脉冲的百分比、网络突发脉冲数量、网络突发脉冲频率、网络突发脉冲持续时间、网络突发脉冲中动作电位的平均值、网络突发脉冲中动作电位间间隔(isi)的平均值、参与形成网络突发脉冲的电极数量、网络突发脉冲中突发脉冲的百分比、网络突发脉冲中的突发脉冲间间隔(ibi)的变异系数、互相关曲线下的表面积和同步指数；

163、-它还包括用于在神经网络状态的至少一个特征参数和神经网络状态的至少一个特征参数的参考值之间进行比较以确定生物样品的影响的装置；

164、-多隔室微流体装置还包括第三隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第三隔室(1,3)之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第三隔室之间的神经连接的通讯(图2)；有利地，第四隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第四隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第四隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第三隔室和第四隔室之间的神经连接的通讯(图3)；优选地，第五隔室和至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第一隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第二隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第三隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯和/或至少一个形成生物接口的装置，以实现通过第四隔室和第五隔室之间的神经连接的通讯(图4)；

165、-它可能包含在便携式或非便携式套件中，旨在确定生物样品对生物模型的影响，最终建立神经学疾病和/或神经疾病的鉴别诊断。

166、本发明还涉及前述生物感受器以及包含所述生物感受器的生物传感器在用于诊断神经学疾病或神经疾病的体外或离体方法中的用途，所述神经学疾病或神经疾病有利地选自由以下组成的组：阿尔茨海默病；帕金森病；头部创伤；脑血管意外、血栓性或栓塞性闭塞或缺血；短暂性脑缺血发作；sars-cov-2感染的神经元形式；神经元中毒，例如对有机磷化合物的中毒；镇痛；神经炎性疾病，例如多发性硬化症、耳神经炎、脊髓炎、狼疮、克罗恩病；听觉神经损伤导致的听力损伤；肌萎缩侧索硬化症；视网膜神经病变，例如糖尿病引起的；癫痫、牛皮癣、疱疹；脑膜脑炎；孤立性淋巴细胞性脑膜炎；格林-巴利综合征或单神经根型(mononevrite type)多发性神经根神经炎；周围神经病变和脊髓病。

167、本发明还涉及前述生物感受器以及包含所述生物感受器的生物传感器在用于监测神经学疾病或神经疾病的预防性和/或疗效性治疗得体外或离体方法中的用途，有利地，所述治疗是通过基因疗法、细胞疗法、轴突再生疗法、施用一种或多种疗效性和/或预防性和/或麻醉性试剂的治疗。

168、本发明还涉及前述生物感受器以及包含所述生物感受器的生物传感器在用于快速且灵敏地筛选作为潜在药物的试剂或检测试剂的方法中的用途。事实上，本发明的装置允许识别检测试剂的可能治疗效果，以及评估被识别为药物的该试剂的生理相关浓度(例如，在处方剂量时特定组织中存在的量)。将检测试剂间接施用于第一隔室中的神经元培养物产生了可识别的或特征性的功能活性信号，从而允许快速且有效地评估试剂的治疗效果。参考附图，通过以下实施方案以非限制性的方式说明了本发明。

169、据认为，在没有进一步说明的情况下，鉴于说明书和实施方案，本领域技术人员应该能够实施和使用要求保护的方法和生物感受器。

170、本发明还涉及一种用于确定生物样品对生物模型的影响的体外或离体方法，包括以下步骤：

171、a.提供包括多隔室微流体装置(10)的生物感受器，该装置包括:

172、i)至少第一隔室(1)和第二隔室(2)；

173、ii)至少一个形成生物接口(21)的装置，用于实现通过第一隔室和第二隔室之间的神经连接的通讯；

174、iii)每个隔室培养至少一种类型的细胞或外植块，第一隔室(1)至少包含神经网络形式的神经元培养物，可被施用所述生物样品的第二隔室(2)至少包含神经网络形式的神经元培养物和/或非神经元细胞培养物或外植块培养物；

175、iv)至少一个能够在第一隔室中空间分布的多个测量点上记录神经元的功能活动的装置(40)，该装置可以与将功能活动转换为数据的装置(50)结合；

176、b.将第一隔间中培养的神经元或第二隔室中培养的神经元和/或非神经元细胞或外植块与生物样品直接或间接接触；

177、c.在根据步骤b)所述将第一隔室(1)中培养的神经元与生物样品的接触之后的测量持续时间内，在多个测量点上记录第一隔室(1)中培养的神经元的功能活动；

178、d.将第一隔室(1)中培养的神经元的功能活动记录转换为功能活动数据；

179、e.分析在步骤d)中获得的功能活动数据并构建表示神经网络的图；

180、f.由功能活动数据确定第一隔室(1)中神经网络状态的至少一个特征参数，该至少一个参数选自由以下组成的组：

181、i)连接系数；

182、ii)节点间最小长度的平均值；

183、iii)每秒动作电位的平均值；

184、iv)网络连通性指数或“小世界指数”；

185、v)z分数或“z-分数”；

186、vi)参与系数或“参与系数”；和

187、vii)节点的中心性指数；

188、g.比较神经网络状态的至少一个特征参数和神经网络状态的至少一个特征参数的参考值以确定所述生物样品的影响。