基于KIF20A蛋白的温敏水凝胶疫苗、制备方法及应用

本发明属于生物，涉及肝癌疫苗的制备，具体涉及基于kif20a蛋白的温敏水凝胶疫苗、制备方法及应用。

背景技术：

1、世界范围内肝癌发病率占所有恶性肿瘤第6位，死亡率占第3位。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是肝癌最常见的组织学分型，占80％以上[1]。在中国，原发性肝癌的发病率在恶性肿瘤中排名第4位，死亡率第2位，严重危害国民生命和健康。

2、pd-1/l1阻断治疗是hcc系统性治疗的重要方式，临床疗效普遍优于靶向治疗和化疗，但依旧无法满足中晚期hcc患者长期生存的需求。因此，增强pd-1/l1免疫检查点阻断治疗的疗效，提高客观缓解率，对改善晚期hcc肝癌患者预后具有重要意义，这不仅是目前亟需解决的临床问题，也是当前重大的临床需求。

3、肿瘤疫苗是一种新型的肿瘤免疫治疗方法，旨在通过激发机体的免疫系统来攻击并杀死肿瘤细胞。目前，世界范围内也有多项肿瘤疫苗的临床试验正在进行，因此，肿瘤疫苗是一种可以有效激活cd8+t细胞功能并具有广泛临床转化前景的治疗方法。然而，目前hcc疫苗临床试验使用的抗原，如甲胎蛋白(α-fetoprotein,afp)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,gpc3)、类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,htert)等，免疫激活效果普遍不是特别理想。因此，发现更有效的疫苗抗原是目前的迫切需求。

4、驱动蛋白家族成员20a(kinesin family member 20a,kif20a)又名mklp2(mitotic kinesin-like protein 2)，是一种微管马达蛋白。kif20a在细胞分裂过程中起重要作用，特别是在有丝分裂的后期，它参与细胞质分裂(细胞器的分配)和中心体的定位。在hcc中，kif20a的表达水平显著升高，并与hcc恶性程度大、预后不良以及生存率低相关。本课题组前期研究指出，kif20a促进了hcc的染色体不稳定性，进而介导了hcc的恶性生物学行为。kif20a在hcc细胞中高表达，而在正常组织中表达较低，是一种相对较新的taa，其疫苗也用于多种恶性肿瘤治疗，但尚未见针对hcc治疗效果的研究。目前，虽然有使用kif20a多肽作为肿瘤疫苗的相关研究，但是仅针对单一人类白细胞抗原(human leukocyteantigen,hla)亚型的限制性表位，难以在人群中广泛推广。此外，多肽仅提供单一的抗原表位，往往仅能激活单一的免疫反应，而有效的免疫反应通常需要b细胞、cd4+和cd8+t细胞的同时激活，因此既往研究kif20a多肽疫苗效果也不理想，而使用kif20a蛋白免疫源性更强，可以提供更多抗原表位，因此，使用完整蛋白作为抗原可以在一定程度上克服多肽的局限性。

5、脂质体作为一种合成的磷脂囊泡，已被美国和中国食品药品监督管理局批准用于临床，是一种安全、稳定、适用性广的递送平台。此外，脂质体对淋巴结具有良好地靶向性，还能保护抗原，使其免受过早降解而丧失免疫源性。因此，将kif20a蛋白和免疫佐剂r848负载到脂质体中，实现抗原和免疫佐剂的同步递送，不仅在一定程度上可以改善药物分布，还可以提高抗原和免疫佐剂向淋巴结的递送效率，更高效地激发抗肿瘤免疫反应。

6、水凝胶在疫苗的构建方面也展现出广阔的前景。水凝胶是一种三维交联的网状结构，这种结构可以使水凝胶保留大量水分，又可以维持特定的体积和形状。此外，通过不同的设计，水凝胶可以表现出不同的机械强度、孔隙度和自愈性等特点，还可以响应外部环境的变化，如温度、酸碱度和例子浓度等，这使其在药物控释方面展现出广泛的前景。近年来，水凝胶在疫苗领域得到了广泛的应用，它不仅可以对疫苗的有效成分具有保护作用，还可以缓慢释放抗原，避免了疫苗在体内的非特异性分布，从而最小化不良副作用并最大化免疫反应，是新一代肿瘤疫苗的研究热点。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供基于kif20a蛋白的温敏水凝胶疫苗、制备方法及应用，基于kif20a蛋白构建hcc疫苗，进一步通过共递送脂质体和温敏水凝胶合理地优化疫苗性能，增强其免疫激活效率。

2、本发明采用的具体方案为：

3、第一方面，本发明提供基于kif20a蛋白的温敏水凝胶疫苗的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤一、共递送脂质体vac的合成

5、分别称取dotap、胆固醇和dspe-peg2000，溶于氯仿中，超声分散均匀，取定量于圆底烧瓶中，加入r848，充分溶解后，在40℃下真空旋蒸直至溶剂完全蒸发，随后再加入氯仿，重复旋蒸步骤；待旋蒸结束后，圆底烧瓶内壁形成一层薄膜；取kif20a蛋白水溶液，在水浴下超声1分钟水化；将所得溶液吸入脂质体挤出器中，在40℃下将脂质体分别推过200nm孔径和100nm孔径的聚碳酸酯膜；随后，将所得溶液加入纳米透析装置透析12小时；最后，将溶液洗出，加水定容，转移至玻璃瓶内，冻干，得共递送脂质体vac；

6、步骤二、plga-peg-plga三嵌段共聚物水凝胶的合成

7、取一干净的三口圆底烧瓶，加入磁力搅拌子，随后加入peg1500，连接油泵，抽真空、通氮气，排除瓶内氧气残留；随后在油浴锅中加热至120℃并搅拌30分钟，使peg1500充分融化；打开油泵抽真空，继续120℃加热2小时以彻底除去peg1500中可能存在的水分；称取dl-丙交酯和乙交酯，转移至通风橱，向圆底烧瓶内通入氮气，迅速将称好的dl-丙交酯和乙交酯加入瓶内，塞好瓶塞；抽真空，排除瓶内水分和氧气，120℃加热30分钟，使dl-丙交酯和乙交酯溶解并与peg1500充分混合；使用注射器吸取辛酸亚锡，注入圆底烧瓶内，封管，并将温度上升到150℃，维持8小时；待反应降至室温后，向圆底烧瓶内加入二氯甲烷，使粗产物充分溶解，并转移至一平底烧瓶中，加入石油醚，使沉淀析出，过滤，所得固体重新溶于二氯甲烷中，加入石油醚析出沉淀并抽滤，得到高纯度的plga-peg-plga三嵌段共聚物，所得固体在真空环境干燥24小时至恒重，保存待用；

8、步骤三、kif20a温敏水凝胶疫苗csf-vacgel的制备

9、将共递送脂质体vac负载到温敏水凝胶中，制备成温敏水凝胶疫苗csf-vacgel，具体步骤如下：

10、①将步骤二所得plga-peg-plga三嵌段共聚物溶于超纯水，4℃下搅拌24小时，再加入小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子gm-csf，得到csfgel，4℃保存待用；

11、②向csfgel中加入步骤一所得共递送脂质体vac粉末，涡旋使其分散均匀，得到kif20a温敏水凝胶疫苗csf-vacgel。

12、作为对上述制备方法的进一步优化，步骤一中，所述dotap、胆固醇和dspe-peg2000的摩尔量为50:4:5。

13、作为对上述制备方法的进一步优化，步骤二中，dl-丙交酯和乙交酯的摩尔量比为3:1。

14、作为对上述制备方法的进一步优化，步骤三的①中，plga-peg-plga三嵌段共聚物的质量百分比为15％，gm-csf的浓度为10μg/ml；步骤三的②中，共递送脂质体vac的浓度为1mg/ml。

15、第二方面，本发明提供上述的制备方法制备的温敏水凝胶疫苗。

16、第三方面，上述的温敏水凝胶疫苗在制备肝癌疫苗药物中的应用。

17、有益效果：本发明制备基于kif20a蛋白的肝癌疫苗，通过脂质体和plga-peg-plga三嵌段共聚物水凝胶优化疫苗性能，用于增强pd-l1阻断治疗的疗效。具体优势表现有：

18、1.通过脂质体实现kif20a蛋白和免疫佐剂r848的共递送，增强免疫激活效果；

19、2.plga-peg-plga三嵌段共聚物温敏水凝胶实现在体缓释效果；

20、3.上述水凝胶疫苗在小鼠体内增强了pd-l1阻断治疗效果。