一种siRNA药物、及其制药用途的制作方法

本发明属于小干扰核酸药物，具体地，本发明涉及一种sirna药物、及其制药用途，更具体地，本发明涉及一种sirna、sirna缀合物、药物组合物及它们在制药中的用途。

背景技术：

1、rna干扰(rna interference，rnai)是由双链rna(double-stranded rna，dsrna)分子在mrna水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。rna干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，ptgs)。最早有关rna干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的rna干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了rna干扰现象。1999年，hamilton和baulcombe在发生rna干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的rna片段，这些rna片断被证明是rna干扰所必需的，被称为小干扰核酸(sirna)。双链sirna与细胞源性的相关酶和蛋白质形成rna诱导的沉默复合体(rna-induced silencingcomplex，risc)。在rna干扰过程中，双链sirna中的正义链被排除出复合体，反义链指导risc结合到靶mrna的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶iii降解靶mrna，从而关闭靶基因的表达。

2、但是，由于小干扰核酸(sirna)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解。目前通常采用对合成的sirna进行化学修饰，以增加sirna的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的。但是，现有的sirna的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题。

3、因此，亟需开发一种稳定性强、细胞毒性小的sirna。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种sirna，该sirna可抑制hbv的表达和复制，可阻断hbv的一种或多种基因型进入肝细胞。

2、在本发明的一个方面，本发明提出了一种sirna，所述sirna中的每个核苷酸独立地为经修饰或未修饰的核苷酸，其包括一条正义链和一条反义链，所述反义链与所述正义链至少具有部分碱基配对的互补性区域；其中，所述正义链包括如seq id no:1～seq idno:150所示的核苷酸序列中之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异；所述反义链包括seq id no:151～seq id no:300所示的核苷酸序列中之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异。发明人经过实验设计得到上述合适的小干扰rna(sirna)通过形成沉默复合体(rna-induced silencing complex，risc)，与靶标基因(乙型肝炎病毒，简称乙肝病毒、hbv)的mrna的序列互补配对，使乙肝病毒的mrna降解，从而抑制hbv的表达和复制，可有效地预防和/或治疗hbv引起的相关疾病。根据本发明的实施例，上述sirna还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：

3、根据本发明的实施例，所述正义链包括如下核苷酸序列之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异：seq id no:7、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq idno:40、seq id no:41、seq id no:46、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:58、seq idno:69、seq id no:93、seq id no:94、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99、seq idno:115、seq id no:116、seq id no:118、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:123、seq id no:124、seq id no:125、seq id no:127、seq id no:128、seq id no:129、seq idno:130、seq id no:140、seq id no:148和seq id no:150；和/或，所述反义链包括如下核苷酸序列之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异：seq id no:157、seq id no:159、seqid no:162、seq id no:163、seq id no:164、seq id no:165、seq id no:168、seq id no:170、seq id no:171、seq id no:172、seq id no:190、seq id no:191、seq id no:196、seqid no:200、seq id no:201、seq id no:208、seq id no:219、seq id no:243、seq id no:244、seq id no:247、seq id no:248、seq id no:249、seq id no:265、seq id no:266、seqid no:268、seq id no:271、seq id no:272、seq id no:273、seq id no:274、seq id no:275、seq id no:277、seq id no:278、seq id no:279、seq id no:280、seq id no:290、seqid no:298和seq id no:300。

4、根据本发明的实施例，所述正义链包括如下核苷酸序列之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异：seq id no:12、seq id no:20、seq id no:40、seq id no:93、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99、seq id no:115、seq id no:116、seq id no:121、seq idno:123、seq id no:124、seq id no:125、seq id no:129和seq id no:130；和/或，所述反义链包括如下核苷酸序列之一，或与其具有不多于5个核苷酸的差异：seq id no:162、seqid no:170、seq id no:190、seq id no:243、seq id no:247、seq id no:248、seq id no:249、seq id no:265、seq id no:266、seq id no:271、seq id no:273、seq id no:274、seqid no:275、seq id no:279和seq id no:280。

5、根据本发明的实施例，所述sirna包括如下之一：

6、具有如seq id no:12所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:162所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

7、具有如seq id no:20所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:170所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

8、具有如seq id no:40所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:190所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

9、具有如seq id no:93所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:243所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

10、具有如seq id no:97所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:247所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

11、具有如seq id no:98所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:248所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

12、具有如seq id no:99所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:249所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

13、具有如seq id no:115所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:265所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

14、具有如seq id no:116所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:266所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

15、具有如seq id no:121所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:271所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

16、具有如seq id no:123所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:273所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

17、具有如seq id no:124所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:274所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

18、具有如seq id no:125所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:275所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

19、具有如seq id no:129所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:279所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链；

20、具有如seq id no:130所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的正义链，具有如seq id no:280所示的核苷酸序列或与其区别不多于5个核苷酸的核苷酸序列的反义链。

21、根据本发明的实施例，所述正义链和/或反义链包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括至少1个核苷酸。

22、根据本发明的实施例，所述3’突出端或5’突出端包含至少2个核苷酸。

23、根据本发明的实施例，所述正义链和/或反义链包含3’突出端，所述3’突出端包含2个核苷酸。

24、根据本发明的实施例，所述正义链包含5’-gguuuuucuuguugacaaa-3’(seq id no:330)，且所述正义链的长度不超过21个核苷酸，所述反义链包含5’-uuugucaacaagaaaaacccc-3’(seq id no:190)，且所述反义链的长度不超过23个核苷酸，所述正义链和反应链中的每个核苷酸均为经修饰的核苷酸。

25、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立任选地选自下列的至少之一：非天然碱基的核苷酸、脱氧核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2’-o-烯丙基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'–o-烷基修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构型限制性核苷酸、2'-烯丙基修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、吗啉基核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、peg修饰的核苷酸、5'-氨基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-硫代磷酸酯基修饰的核苷酸、5'-甲基膦酸酯基修饰的核苷酸、5'-磷酸酯模拟物修饰的核苷酸、5'-甲基化胞嘧啶修饰的核苷酸。

26、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链中所有核苷酸均为修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立任选地选自2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和5'-硫代磷酸酯基修饰的核苷酸中的至少之一。

27、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链中，2'-氟代修饰的核苷酸存在于以下位置：

28、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第5位、第7位、第8位和第9位；和/或

29、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位。

30、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链中，5'-硫代磷酸酯基修饰的核苷酸存在于以下位置所组成：

31、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位和第2位；和/或

32、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位和第2位，和/或所述反义链的3'末端的核苷酸为起始点的第2位和第3位。

33、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链中，2'-甲氧基修饰的核苷酸存在于以下位置：

34、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第6位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位和第19位；和/或

35、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位、第11位、第12位、第13位、第15位、第17位、第18位、第19位、第20位或第21位。

36、根据本发明的实施例，所述正义链和/或所述反义链中，2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和5'-硫代磷酸酯基修饰的核苷酸存在于以下位置：

37、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第6位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位和第19位；和/或

38、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位、第11位、第12位、第13位、第15位、第17位、第18位、第19位、第20位或第21位；和/或

39、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第5位、第7位、第8位和第9位；和/或

40、所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位和第2位；和/或

41、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第8、第9、第14位和第16位；和/或

42、所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位和第2位，和/或反义链的3'末端的核苷酸为起始点的第2位和第3位。

43、根据本发明的实施例，所述sirna包括如下之一：

44、

45、

46、其中，所述正义链和反义链中，a、g、c和u分别为2'-o-甲基(2'-ome)a、2'-ome g、2'-omec和2'-ome u；af、cf、gf和uf分别为2'-氟a、2'-氟c、2'-氟g和2'-氟u；s表示核苷酸具有5'-硫代磷酸酯基修饰。

47、根据本发明的实施例，所述sirna包括sirna id no:152、sirna id no:153、sirnaid no:155、sirna id no:162、sirna id no:163、sirna id no:164、sirna id no:165和sirna id no:166中之一：

48、

49、其中，所述正义链和反义链中，a、g、c和u分别为2'-o-甲基(2'-ome)a、2'-ome g、2'-omec和2'-ome u；af、cf、gf和uf分别为2'-氟a、2'-氟c、2'-氟g和2'-氟u；s表示核苷酸具有5'-硫代磷酸酯基修饰。

50、在本发明的另一方面，本发明提出了一种sirna缀合物。根据本发明的实施例，所述sirna缀合物包括：本发明前述的sirna；配体，所述sirna与配体相连。本发明的sirna缀合物因为配体的加入，可将很好地将药物递送至细胞，进一步提高对乙肝病毒的mrna的降解，可有效地预防和/或治疗hbv引起的相关疾病。

51、根据本发明的实施例，本发明所述的sirna缀合物还可以进一步包括如下技术特征的至少之一：

52、根据本发明的实施例，所述配体与所述正义链和/或反义链相连。

53、根据本发明的实施例，所述配体与所述正义链和/或反义链通过硫代磷酸酯键或磷酸酯键相连。

54、根据本发明的实施例，所述配体与所述正义链的5’端或3’端连接；或者，所述配体与所述反义链的5’端或3’端连接。

55、根据本发明的实施例，所述配体包括至少一个n-乙酰基-半乳糖胺。

56、根据本发明的实施例，所述配体为galnac化合物。

57、根据本发明的实施例，所述galnac化合物包括l96或其异构体(如立体异构等)、daw4007-4或其异构体(如立体异构等)中的至少之一。

58、根据本发明的实施例，所述缀合物具有如下所述结构或其异构体(如立体异构体)之一：

59、

60、其中，a为本发明所述的sirna。

61、根据本发明的实施例，a为具有如seq id no:312所示的核苷酸序列的正义链和具有如seq id no:328所示的核苷酸序列的反义链的sirna。在本发明一些实施例中，a具体为sirna id no:163:ss(5’-3’)gs-gs-u-u-uf-u-uf-cf-uf-u-g-u–u-g-a–c-a-a-a(seq idno 312)，as(5’-3’)us-ufs-u-g-u-cf-a-af-cf-a-a-g-a-af-a-af-a-c-cs-cs-c(seq idno 328)，ss表示正义链，as表示反义链。

62、在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物包括：本发明前述的sirna或前述的sirna缀合物。由前可知，前述的sirna和sirna缀合物均可使乙型肝炎病毒的mrna降解，抑制hbv的表达和复制。由此，本发明的药物组合物可有效地预防和/或治疗hbv引起的相关疾病。

63、根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。

64、在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的sirna、前述的sirna缀合物或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性。

65、在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的sirna、前述的sirna缀合物或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒引起的相关疾病。

66、根据本发明的实施例，所述乙型肝炎病毒引起的相关疾病包括急性乙型肝炎、急性暴发性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、末期肝病、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

67、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。