基于二氰基异佛尔酮荧光探针的设计合成与评价方法

本发明属于荧光探针，具体为基于二氰基异佛尔酮荧光探针的设计合成与评价方法。

背景技术：

1、荧光探针作为具有重要前景的实用检测工具，在特异性检测中发挥着越来越大的作用，包括但不限于环境污染物的定性和定量检测、病理模型中标志物的早期检测等，在生物体细胞成像方面尤为突出。与电化学分析、元素分析、质谱等传统方法相比，荧光探针技术具有成本低、实时性强、灵敏度高、结果易分析、检测精度高等显著优势。小分子荧光探针作为荧光探针技术的研究热点，其设计和开发受到了分子生物学、生物医学和化学生物学等多学科的关注。在过去的几十年里，传统的荧光基团，如香豆素、bodipy、罗丹明、花菁和半花菁染料等，被广泛用于构建优良的探针，为活细胞中重要靶点的监测和追踪做出了重大贡献。

2、但是上述荧光团在展示其强大的能力的同时，也暴露了以下缺点：

3、1.光稳定性：尽管dcip基团可能有较好的光稳定性，但荧光探针在连续或强烈的激发光照射下仍可能发生光漂白。

4、2.生物降解性：荧光探针的生物降解性是其在生物医学应用中的关键因素。如果探针不能有效地被生物体清除，可能会积累并产生毒性。

5、3.生物分布和清除：探针在体内的分布和清除机制需要仔细研究，以确保它们能够到达目标位置并有效地发挥作用，同时减少非特异性分布。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供基于二氰基异佛尔酮荧光探针的设计合成与评价方法。

2、本发明采用的技术方案如下：基于二氰基异佛尔酮荧光探针的设计合成方法，所述合成方法包括以下步骤：

3、s1:先进行合成二氰基异佛尔酮荧光探针的中间体的制备；称取1.5g d-半乳糖加入150ml的茄型瓶，然后加入5ml乙酸酐将d-半乳糖溶解，随后将体系转移至冰水浴环境反应30分钟，再缓慢滴加0.1ml高氯酸，待搅拌反应6小时后，tlc监测反应完全；用饱和碳酸氢钠将体系的ph调到中性，用乙酸乙酯萃取；用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠吸出多余水分，最后将干燥后的有机层抽滤，把收集到的滤液进行减压旋蒸处理，得到淡黄色糖浆状的粗产品；无需进行纯化所得，直接进行下一步；用10ml二氯甲烷溶解上一步的粗产品，置于冰水浴环境继续反应30分钟，然后缓慢滴加0.35ml氢溴酸，滴加完毕后将反应体系转移室温环境下继续反应6小时，tlc监测反应完全；反应体系后处理同上一步操作，经过多次萃取、干燥、抽滤、减压旋蒸处理，得到白色固体全乙酰溴代半乳糖；所得产物也无需纯化，继续进行下一步反应；将上述已得到的白色固体全乙酰溴代半乳糖溶于20ml dmso，室温条件下，边搅拌边向反应体系中加入nan3；反应4小时后，反应体系用水淬灭，用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠吸出多余水分，最后抽滤，浓缩，用硅胶柱纯化得到白色化合物1；

4、s2:将白色固体1溶解在10ml干燥的甲醇中，搅拌下加入甲醇钠调节反应体系的ph至10，室温下反应4小时，tlc检测反应完全；随后加入去离子交换树脂调节反应体系至中性，再进行抽滤，经减压旋蒸除去溶剂，最后通过硅胶柱纯化分离得到白色的固体化合物2；

5、s3:称取化合物三苯基膦和1,4-二溴丁烷置于干燥的100毫升茄形瓶中，加入20ml甲苯充分溶解,在120℃氮气保护条件下回流12小时，反应结束后冷却至室温，减压抽滤除去溶剂，用甲苯洗涤三次，得到白色粉末状固体化合物3；

6、s4:称取化合物3置于干燥的25ml圆底烧瓶中，用5ml n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后加入叠氮化钠，在氮气保护下室温反应3小时，加入10ml去离子水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，合并有机相并加入无水硫酸钠吸走多余水分，减压除去溶剂，再用油泵抽去多余的n,n-二甲基甲酰胺，得到棕黄色固体化合物4；

7、s5:称取n-吗啉和叠氮化钠溶于20ml n,n-二甲基甲酰胺中，在50℃氮气保护条件下回流3小时,反应结束后冷却至室温，加大量水后用乙酸乙酯萃取，然后减压除去溶剂，得到化合物5；

8、s6:将异佛尔酮、丙二腈、三水合乙酸钠和9ml乙醇放入烧瓶中；混合物在50℃下搅拌加热过夜；然后减压除去溶剂；残留物经石油醚/二氯甲烷洗脱，得到白色固体化合物6；

9、s7:将2,4-二羟基苯甲醛、3-溴丙炔和碳酸钾溶于乙腈；反应混合物在氮气环境下于80℃回流30分钟；然后减压除去溶剂；残留物经二氯甲烷/石油醚洗脱，得到白色固体化合物7；

10、s8:将化合物7和化合物6溶于乙腈，然后加入哌啶；混合物在氮气环境下于80℃回流6小时，然后减压除去溶剂；残留物用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到黄色化合物8；

11、s9:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺；反应混合物在0℃搅拌30分钟；然后向溶液中逐渐加入丙烯酰氯反应30分钟，减压除去溶剂；残留物用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体化合物9；

12、s10:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺；反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后向溶液中逐渐加入3-噻吩甲酰氯反应1小时，减压除去溶剂；残留物经石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体化合物10；

13、s11:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺；反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后向溶液中逐渐加入乙酰氯反应1小时，减压除去溶剂；残留物经石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到橙黄色固体化合物11；

14、s12:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺；反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后向溶液中逐渐加入苯甲酰氯反应40分钟，减压除去溶剂；残留物用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到化合物12；

15、s13:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺；反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后向溶液中逐渐加入环丙基甲酰氯反应30分钟，减压除去溶剂；残留物用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到化合物13；

16、s14:将化合物8溶解在10ml无水二氯甲烷中，在0℃的氮气环境下向溶液中逐渐加入三乙胺，反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后向溶液中逐渐加入二甲氨基甲酰氯反应50分钟，减压除去溶剂；残留物用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到橘色固体化合物14；

17、s15:将化合物8、4-硝基苄溴、碳酸钾溶解在15ml n,n-二甲基甲酰胺中，反应混合物在室温下搅拌4小时，减压除去溶剂；残留物经石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体化合物15；

18、s16:将化合物8、2,4-二硝基氟苯、碳酸钾溶解在20ml n,n-二甲基甲酰胺中，反应混合物在室温下搅拌6小时，减压除去溶剂；残留物用柱色谱法纯化，其中石油醚/乙酸乙酯＝15:1，得到橙色化合物16；

19、s17:进行目标化合物的合成：将抗坏血酸钠和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室温下搅拌30分钟；然后将混合物加入溶有化合物9和化合物2的thf溶液中，反应12小时；用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除去水分，减压蒸发溶剂；用二氯甲烷/甲醇为洗脱剂，得到黄色固体dcx-1，之后即可结束整个基于二氰基异佛尔酮荧光探针的设计合成方法。

20、在一优选的实施方式中，所述步骤s17中，将抗坏血酸钠和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物加入溶有化合物10和化合物2的thf溶液中，反应过夜。用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠除去多余水分，减压除去溶剂。残留物经二氯甲烷/甲醇洗脱，得到黄色固体dcx-2。

21、在一优选的实施方式中，将抗坏血酸钠和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物加入溶有化合物11和化合物2的thf溶液中，反应过夜。用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠吸干多余水分，减压除去溶剂。残留物经二氯甲烷/甲醇洗脱，得到黄色化合物dcx-3。

22、在一优选的实施方式中，将抗坏血酸钠和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物加入溶有化合物13和化合物2的thf溶液中，反应过夜。用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠吸走多余水分，减压除去溶剂。残留物用二氯甲烷/甲醇洗脱，得到黄色固体dcx-5。

23、在一优选的实施方式中，将抗坏血酸钠和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室温下搅拌30分钟。然后将混合物加入溶有化合物14和化合物2的thf溶液中，反应过夜。用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠吸去水分，减压蒸发溶剂。残留物用二氯甲烷/甲醇洗脱，收到黄色目标物dcx-6。

24、在一优选的实施方式中，评价方法包括以下步骤：

25、s1:进行光谱的测试，称取一定量的dcx-1和cys分别溶于dmso和pbs中，制成10mm的探针dcx-1储备液和50mm的cys储备液。其他测试溶液，如小分子硫醇、阴离子、阳离子、氨基酸等，均溶解在pbs中，制成浓度为50mm的溶液。紫外光谱和荧光光谱的扫描范围为460-800nm。狭缝宽度为5nm×5nm。测试内容包括紫外光谱实验、荧光选择性实验、探针的抗干扰性实验、浓度滴定实验、job plot等实验

26、s2:进行细胞毒性实验，将lo2细胞接种到96孔板中，在37℃，5％ co2条件下孵育24小时，再用不同浓度的探针处理24小时。除去上清液并加入10μl mtt。在37℃条件下再孵育4小时，最后用elx800吸光度酶标仪记录在488nm处的吸光度

27、s3进行探针在细胞中的检测，首先将hepg2细胞均匀接种到24孔板中培养24小时，然后对培养的hepg2细胞进行不同的处理，分为空白细胞组、纯探针组、cys补充组和nem预处理组。纯探针组:10μm探针dcx-1孵育30分钟，然后固定并滴加抗荧光淬灭剂。cys补充组：10μm探针dcx-1孵育30分钟，用pbs洗涤3次。然后探针dcx-1与100μm cys一起孵育60分钟，用pbs洗涤3次，然后固定并滴加抗荧光淬灭剂。nem预处理组：用1mm nem预处理细胞2小时，用pbs洗涤3次，然后加入10μm探针dcx-1孵育30分钟，固定并滴加抗荧光淬灭剂。

28、为了探究探针dcx-1能否精准定位到肝细胞，对hepg2、a549、hela和sgc-7901四种细胞进行相同的处理。然后将抗荧光淬灭剂滴加到载玻片上，扣紧并密封。所有图像均由leica sp8激光扫描共聚焦显微镜采集。探针的激发波长为488nm，发射波长的收集范围为560-650nm。

29、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

30、1、本发明中，设计并合成出8个以β-半乳糖为靶向基团的肝细胞靶向荧光探针，通过连接不同的识别基团(乙酰氯、丙烯酰氯、噻吩甲酰氯、苯甲酰氯、2,4-二硝基氟苯等)，用于检测cys、h2s、过氧化氢、硝基还原酶、乙酰胆碱酯酶等生物标志物，通过1h nmr、13c nmr和hr-esi-ms表征确定了每个化合物的结构。设计并合成出6个以吗啉为靶向基团的溶酶体靶向荧光探针，通过连接不同的识别基团(丙烯酰氯、4-硝基苄溴、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯等)，用于检测cys、h2s、过氧化氢、羧酸酯酶、胰凝乳蛋白酶等生物标志物，通过1h nmr、13cnmr和hr-esi-ms表征确定了每个化合物的结构。

31、2、本发明中，设计并合成出6个以三苯基膦为靶向基团的线粒体靶向荧光探针，通过连接不同的识别基团(4-硝基苄溴、噻吩甲酰氯、乙酰氯、环丙基甲酰氯等)，用于检测h2s、cys、过氧化氢、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等生物标志物，通过1h nmr、13cnmr和hr-esi-ms表征确定了每个化合物的结构。

32、3、本发明中，设计合成的探针dcx-1结构中含有丙烯酸酯单元，能够选择性的与半胱氨酸进行反应，形成硫醇化合物并脱去一分子七元环，释放出荧光结构，从而发出强烈的荧光。探针dcx-1对半胱氨酸具有较强的选择性，只能响应半胱氨酸，对其他分析物(clo-、co32-、so42-、i-、br-、hs-、cu2+、na+、ca2+、fe3+、h2o2、gsh、hcy、gln、gly、tyr、arg、lys、bsa、胰蛋白酶、溶菌酶、维生素c、尿素等)无响应。探针dcx-1具有出色的抗干扰能力，不会受到gsh、hcy、gln、tyr、arg、ala、ile、lys、phe、met、thr、gly、his的影响。探针dcx-1的斯托克斯位移可以达到173nm，检测限低至0.31μm,能够对半胱氨酸快速响应，在生理ph条件下稳定。探针dcx-1具有良好的细胞和组织穿透性，可用于检测细胞和斑马鱼中的内源性和外源性半胱氨酸。由于引入了半乳糖基团，因此具有出色的肝细胞靶向性和低细胞毒性。探针dcx-1可用于生物体内半胱氨酸的精准检测，为检测半胱氨酸相关疾病提供了有效工具，并有助于了解半胱氨酸在生命系统中的作用和功能。

33、4、本发明中，本文基于荧光探针的设计原理和经典的有机合成方法，首次设计并成功合成出一系列基于二氰基异佛尔酮荧光基团的，同时具有靶向能力和相关指标检测能力的双功能荧光探针dcx-1～20，能够精准定位到肝细胞、溶酶体和线粒体，可以用于检测h2s、cys、过氧化氢、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等生物标志物。合成的代表性肝靶向荧光探针dcx-1具有优异的光物理特性，对cys良好的选择性,对其他分析物(clo-,co32-,so42-,i-,br-,hs-,cu2+,na+,ca2+,fe3+,h2o2，gsh，hcy，gln，gly，tyr，arg，lys，bsa，胰蛋白酶，溶菌酶，维生素c，尿素等)没有响应，卓越的抗干扰能力，良好的稳定性，较低的细胞毒性，优良的活细胞成像及肝靶向能力，并且可以用于斑马鱼体内的cys成像，实现了生物体内尤其是肝细胞中cys的可视化。