一种基于序贯温控的复合多孔水凝胶微球制备方法和应用

本发明属于生物材料与细胞培养交叉，具体涉及一种基于序贯温控的复合多孔水凝胶微球制备方法和应用。

背景技术：

1、三维(3d)细胞培养相较于传统的二维(2d)培养方式，更贴近生物体内真实的组织结构与细胞间复杂的相互作用，进而为研究者提供一个更加精确的生物体内微环境的模拟平台。在进行细胞行为的研究过程中，3d培养模式显著优于2d培养，它能更准确地展现细胞迁移的动态过程，并深刻揭示细胞间的协同作用机制。此外，3d培养技术还能有效减少细胞在体外培养过程中受到的损伤，从而大幅度提高细胞的存活率，使细胞保持更好的生物活性和生理状态。3d细胞培养的可操作性很强，可以根据不同细胞生存所需，为其提供更加适宜的生长环境。目前，已经涌现出多种三维细胞培养的方法，如强制浮动法、搅拌法以及支架法等。3d细胞培养在生物学以及医学领域均拥有广泛的应用前景，不仅为临床治疗提供了新的策略和手段，也为科学研究开辟了新的方向。

2、水凝胶具有生物可降解性和良好的生物相容性，可用于模仿天然细胞外基质的关键特征，从而促进细胞的增殖分化以及组织再生，最终实现对受损组织的修复与重建。明胶、透明质酸和胶原蛋白等都是很好的水凝胶支架材料，可用来进行药物递送、促进血管再生以及骨修复。明胶作为ph敏感的天然高分子蛋白质，因其生物相容性、非免疫原性及低成本而被广泛应用。其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列和基质金属蛋白酶(mmp)敏感的位点可促进细胞结合，支持细胞增殖。另外，利用明胶为基础材料制备的微球(gmss)可作为药物或细胞递送的高效载体。但明胶降解速度较慢，力学性能较差，使得在使用明胶制备需保持稳定形态和优良力学性能的水凝胶生物支架时，面临着许多困难和挑战。壳聚糖由甲壳素衍生而来，是一种天然碱性阳离子聚合物。利用壳聚糖制备的带正电的生物支架可更好地吸引细胞黏附，有利于细胞黏附增殖。壳聚糖在制备缓释材料和药物载体方面具有天然优势，但其分子结构中含有大量的羟基(-oh)和氨基(-nh2)活性基团，这些基团极易形成氢键而使得其水溶性较差，在大多数有机溶剂中均不溶解，极大地限制了壳聚糖的应用。

3、在现有的研究中，已存在将明胶与壳聚糖联合使用制备生物支架，以提高支架性能。但由于壳聚糖极不易溶，且明胶与壳聚糖的凝固点不同，在大多研究中均无法实现将明胶和壳聚糖均匀混合，多采用分层交联的方式来整合二者的优势，这种方式无法将复合的优势完全发挥出来。另外，经研究发现，在常规形状中球形水凝胶比块状水凝胶拥有更大的比表面积，且尺寸小，更利于微组装。搅拌法是最常见的水凝胶微球制备方法，其操作简单，对仪器要求低，便于大规模生产。但在利用搅拌法制备微载体的过程中，可控性较差，液滴的大小和分散性受混合的程度和时间的影响，微球很难控制其大小，对乳化剂的用量、各个阶段的最适温度和时间的准确把控仍需进一步探索。

技术实现思路

1、本发明是为了针对在制备微载体的时候壳聚糖不易溶解，无法调控水凝胶微球的尺寸的技术问题。

2、本发明提供一种基于序贯温控的复合多孔水凝胶微球制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：

3、步骤1：称取0.2 -0.4g甲基丙烯酸酐改性明胶，溶于含体积分数0.5％-2％光引发剂的2ml-4ml 1×pbs中获得终浓度为10％-20％的明胶溶液；

4、步骤2：称取0.01g-0.02g甲基丙烯酸酐改性壳聚糖，溶于含体积分数0.5％-2％光引发剂的1ml-2ml 1×pbs中获得终浓度为1％-2％的壳聚糖溶液；

5、步骤3：将步骤1获得的明胶溶液与步骤2获得的壳聚糖溶液置于37-50℃水浴中避光混合获得混合溶液；

6、步骤4：将0.01g-0.1g乳化剂溶于步骤3获得的混合溶液中，得到预聚液；

7、步骤5：将0.06g-0.24g乳化剂溶于15ml-60ml的石蜡油中，即得到含0.1％-0.4％span-80的油相溶液；

8、步骤6：将步骤4获得的预聚液以0.1-1ml/min的速度缓慢滴入步骤5获得的油相溶液中，并于20-22℃下400-1000rpm避光搅拌30-60min获得w/o乳液，以100mw/cm2的光照强度，在405nm的蓝光下暴露30s-5min进行光固化，得到明胶微球；

9、步骤7：将步骤6获得的微球进行去油处理，然后置于-20℃下冷冻0-30min后移至-80℃下冷冻0-10min，最后置于液氮中速冻5-10min进行梯度冷冻，并进行冻干处理，得到明胶-壳聚糖复合多孔水凝胶微球。

10、进一步地限定，步骤1中获得甲基丙烯酸酐改性明胶的方法如下：

11、(1)称取10g明胶溶于含100ml的1×pbs中；

12、(2)在50℃条件下400rpm搅拌30min以加速溶解；

13、(3)向其中缓慢加入5ml甲基丙烯酸酐反应2h；

14、(4)将反应后溶液倒入截留分子量为14kda的透析袋中，40℃下透析7d；

15、(5)对透析后的明胶进行冻干处理，得到改性后明胶。

16、进一步地限定，步骤2获得甲基丙烯酸酐改性壳聚糖的方法如下：

17、(1)称取1.5g壳聚糖溶于100ml的4％(v/v)冰醋酸中；

18、(2)室温下搅拌12h以加速溶解；

19、(3)向其中缓慢加入6ml甲基丙烯酸酐于40℃下400rpm避光搅拌12h；

20、(4)将反应后溶液倒入截留分子量为14kda的透析袋中，40℃下透析7d；

21、(5)对透析后的壳聚糖进行冻干处理，得到改性后壳聚糖。

22、进一步地限定，所述光引发剂为lap。

23、进一步地限定，所述乳化剂为tween-60和span-80。

24、进一步地限定，步骤7中的去油处理的方法为加入5ml丙酮清洗3次。

25、本发明提供一种上述的制备方法获得的明胶-壳聚糖复合多孔水凝胶微球。

26、本发明提供一种上述的明胶-壳聚糖复合多孔水凝胶微球在以非诊断和治疗为目的的制备生物支架中的应用。

27、本发明提供一种上述的明胶-壳聚糖复合多孔水凝胶微球在以非诊断和治疗为目的的培养细胞中的应用。

28、本发明提供一种上述的明胶-壳聚糖复合多孔水凝胶微球在以非诊断和治疗为目的的促进血管生成或促进成骨分化中的应用。

29、将改性分为溶解阶段、改性阶段、纯化阶段及冻干阶段四个阶段，将微球制备分为溶解阶段、乳化阶段、固化阶段及梯度冷冻阶段四个阶段，以上八个阶段均有对温度的控制，形成序贯温控。

30、本发明提供了一种明胶和壳聚糖的改性方法，包括如下步骤：

31、s1、溶解阶段：将明胶和壳聚糖在搅拌下溶解，其中明胶溶于1×pbs，溶解温度约为4-50℃，优选约50℃，溶解时间约为20-40min，优选约30min。壳聚糖溶于冰醋酸，浓度为1-10％(v/v)，优选在4％(v/v)冰醋酸下溶解，溶解温度约为4-50℃，优选约23℃，溶解时间约为12-48h，优选为12h。

32、s2、改性阶段：向s1溶液中缓慢滴入甲基丙烯酸酐，避光搅拌，温度为37-50℃，优选为40℃。其中，明胶溶液反应时间为1-12h，优选为2h。壳聚糖溶液反应时间为12-48h，优选时间为12h。

33、s3、纯化阶段：将s2所得溶液进行纯化处理，优选透析法，透析温度为37-50℃，优选约40℃。

34、s4、冻干阶段：将s3所得溶液进行冻干处理，冻干时间3-7d，优选约5d，得到改性后的明胶和壳聚糖。

35、本发明提供了上述明胶-壳聚糖多孔水凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：

36、s1、溶解阶段：将冻干后材料溶于pbs中，优选溶解温度为50℃，并加入光引发剂。

37、s2、乳化阶段：将明胶和壳聚糖溶液按比例配置成预聚液，加入乳化剂，置于水浴锅中充分溶解，优选温度为50℃。将预聚液缓慢滴入含乳化剂的油相中，避光搅拌，环境温度为19-25℃，优选为20-22℃。

38、s3、固化阶段：对收集得到的w/o乳液进行光固化处理，并对微球进行清洗。

39、s4、梯度冷冻阶段：将微球置于-20℃，-80℃及液氮中梯度冷冻，并进行冻干处理，得到多孔微球。

40、有益效果：第一方面，该复合水凝胶微球球体透明，表面孔隙均匀，可降解，具有良好的生物相容性，可支持细胞的增殖黏附，图6图7均为生物相容性的数据支持。

41、第二方面，该微球集明胶与壳聚糖优势于一身，特别是具备了壳聚糖表面所携带的正电荷属性，进一步增强了微球对细胞的吸附能力，细胞吸附效果在荧光图中即可观察到。

42、第三方面，通过调整制备过程中乳化剂的用量，可控制微球粒径大小为数十至数百微米，以适应不同的组织工程需求。此外，本发明结合梯度冷冻技术，赋予了微球多孔结构，增大了微球表面粗糙度和比表面积，从而为细胞的黏附和生长提供了理想微环境。控制尺寸可以使得微球适应不同的组织工程需求，根据所使用的环境不同来选取不同尺寸的微球。尺寸的控制依赖于乳化剂的用量和搅拌时的环境温度。大尺寸指未加乳化剂，仅通过改变搅拌温度，使微球直径在150-350μm之间，小尺寸则指加入乳化剂，并通过对温度的把控，使得微球直径在30-60μm之间，乳化剂是tween-60和span-80，石蜡油是为了提供油相环境。

43、第四方面，该微球可有效地促进血管生成，在促进成骨分化方面也有着潜在的应用前景，在实施例中所用到的mc3t3-e1即小鼠胚胎成骨细胞前体细胞，目前该微球可支持该细胞的生长并促进细胞增殖。

44、将材料进行改性处理，通过调整乳化剂的用量来控制微球尺寸，并实施序贯温控以实现复合材料的相互融合，从而得到尺寸可调的匀相复合水凝胶微球，搅拌法是将水相置于油相中并通过物理搅拌使得水相被分散成小的液滴，后期经过洗涤并除去油相，得到微载体，石蜡油是为了提供油相环境。