一种抗副鸡禽杆菌的单克隆抗体、其标记的免疫磁珠及其应用

本发明属于病原菌分离，具体涉及一种抗副鸡禽杆菌的单克隆抗体、其标记的免疫磁珠及其应用。

背景技术：

1、传染性鼻炎(infection coryza，ic)是由副鸡禽杆菌(avibacteriumparagallinarum,apg)引起的鸡急性呼吸系统传染病，与蛋鸡产蛋量下降和生长缓慢有关。该病在临床症状中一般表出现流鼻涕、面部肿胀、流泪、结膜炎等症状，患有该病的鸡在副鸡禽杆菌和其他病原体混合感染后死亡率高，发病快且传播迅速，对养鸡业造成的经济损失大。

2、直接检测样品中的副鸡禽杆菌会受到多种机会细菌和其他成分的影响，对于样品中副鸡禽杆菌的检测，需要先利用样品前处理方法，去除中存在的干扰性物质和难以忽略的背景信号干扰，以此提高后续检测方法的灵敏度及特异性。此外，在进行检测之前，需要将样品中的目的菌进行浓缩富集，以达到检测方法的检测限。传统的培养方法需要18-24h才能将目的菌的浓度培养到后续检测方法的检测限。而细菌富集技术可以在几十分钟内快速地将样品中的目的菌进行浓缩。在众多应用于样品处理的富集技术中，基于抗原抗体反应的免疫磁珠分离技术是目前的研究热点，该技术有诸多优点，如缩短微生物检测的培养时间、去除基质中影响测定的物质、减少需提供的样本量等等，从而实现微生物的快速富集，尤其对于原始浓度低的样品，富集技术有利于提高分析方法的准确度，拓展检测技术的应用范围，同时还可以帮助改进检测低水平病原或散发性污染所需的采样技术。该技术已经广泛地用于病原微生物的快速富集和检测应用中。

3、单克隆抗体(简称单抗)可以特异性地识别并结合其对应的抗原，基于抗原抗体反应的免疫磁珠分离技术中，获得特异性单抗是其最关键的技术，亲和力高、特异性强的单抗是免疫磁珠技术达到高捕获率和高特异性的必要条件，单抗与磁珠偶联制备免疫磁珠，进一步通过优化多种反应条件，在磁场的作用下，可实现样品中的病原微生物的快速、高效和特异性的富集，进而用于目标病原的分离和检测。

技术实现思路

1、为解决现有技术中直接检测食品中副鸡禽杆菌时，无法兼顾快速简单、特异性和敏感性的缺陷，本发明提供了一种抗副鸡禽杆菌的单克隆抗体、其标记的免疫磁珠及其应用。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明的第一方面提供了一种抗副鸡禽杆菌的单克隆抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，

4、所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seq idno:10所示，所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no:11所示，所述lcdr1的氨基酸序列如seqid no:3所示，所述lcdr2的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述lcdr3的氨基酸序列如seqid no:5所示。

5、在本发明一实施方案中，所述轻链可变区和/或重链可变区的框架区为鼠源框架区。

6、在本发明一实施方案中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示或与seq id no:6具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

7、在本发明一实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:12所示或与seq id no:12具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

8、在本发明一实施方案中，所述单克隆抗体为全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2或fv，所述fv优选scfv。

9、在本发明一实施方案中，所述单克隆抗体为全长抗体。

10、在本发明一实施方案中，所述抗体的重链恒定区优选源自鼠源重链igg2a恒定区或其变体，轻链恒定区优选源自鼠源轻链κ链恒定区或其变体。

11、在本发明一具体实施方案中，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no:2所示；和/或，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no:8所示。

12、本发明的第二方面提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如本发明第一方面所述的单克隆抗体。

13、在本发明一实施方案中，所述单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no:1所示；和/或，所述单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no:7所示。

14、本发明的第三方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如本发明第二方面所述的分离的核酸。

15、在本发明一实施方案中，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

16、本发明的第四方面提供了一种转化体，所述转化体包含如本发明第二方面所述分离的核酸或如本发明第三方面所述的重组表达载体，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

17、在本发明一实施方案中，所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞。

18、本发明的第五方面提供了一种制备抗副鸡禽杆菌的单克隆抗体的方法，所述方法包含以下步骤：

19、培养如本发明第四方面所述的转化体，从培养物中获得所述单克隆抗体。

20、本发明的第六方面提供了一种抗体偶联的免疫磁珠，所述抗体为本发明第一方面所述的单克隆抗体。

21、在本发明一实施方案中，在所述免疫磁珠中，磁珠与单克隆抗体的质量比例为4:(1～3)，优选为4:(2～3)，更优选为4:2。

22、在本发明一实施方案中，所述磁珠的直径为180～2000nm，优选为750nm。

23、在本发明一实施方案中，所述磁珠为活化的磁珠；优选地，所述活化采用edc溶液和nhs溶液；更优选地，所述edc溶液和/或nhs溶液的浓度为2～8mg/ml，例如5mg/ml；和/或，所述edc溶液和nhs溶液的体积比为1:1～5，例如1:1。

24、在本发明一实施方案中，所述偶联的条件为10～100rpm偶联3h以上，优选为30rpm偶联3h以上。

25、在本发明一实施方案中，所述偶联采用的偶联缓冲液为pbst缓冲液；优选地，所述pbst缓冲液的浓度优选为0.005～0.015m，例如为0.01m；和/或，所述pbst缓冲液的ph为6.0～8.0，例如为7.0。

26、本发明的第七方面提供了如本发明第一方面所述的单克隆抗体、如本发明第二方面所述的分离的核酸、如本发明第三方面所述的重组表达载体、如本发明第四方面所述的转化体或如本发明第六方面所述的免疫磁珠在制备富集、分离和/或检测副鸡禽杆菌的试剂盒中的应用。

27、在本发明一实施方案中，所述副鸡禽杆菌选自血清型a副鸡禽杆菌、血清型b副鸡禽杆菌和血清型c副鸡禽杆菌中的一种或多种。

28、本发明的第八方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的单克隆抗体或如本发明第六方面所述的免疫磁珠。

29、本发明的第九方面提供了一种富集、分离副鸡禽杆菌的方法，所述方法包括使用如本发明第六方面所述的免疫磁珠或如本发明第八方面所述的试剂盒与待测样品接触，对所述待测样品中的副鸡禽杆菌进行分离和富集。

30、在本发明一实施方案中，所述方法选自以下条件中的一种或多种：

31、(1)所述副鸡禽杆菌选自血清型a副鸡禽杆菌、血清型b副鸡禽杆菌和血清型c副鸡禽杆菌中的一种或多种；

32、(2)所述接触的时间为40～90min；优选为45min～75min；

33、(3)以副鸡禽杆菌的浓度为104cfu/ml计，所述单克隆抗体的使用质量为0.2～0.3mg，例如0.2mg、0.3mg；和/或，所述磁珠的使用质量为0.2～0.5mg，例如为0.4mg。

34、在本发明一实施方案中，所述方法为诊断目的的。

35、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

36、本发明所用试剂和原料均市售可得。

37、本发明的积极进步效果在于：

38、为建立针对样品中副鸡禽杆菌的快速富集和检测方法，本研究利用副鸡禽杆菌免疫小鼠，经细胞融合筛选，制备了抗副鸡禽杆菌的单抗，该抗体特异性强、敏感性好。本发明制备得到的抗副鸡禽杆菌单抗的效价高(例如可达1:20,480,000)，且所述单抗的特异性强；并适用于基于单抗的免疫磁珠的制备，制备得到的免疫磁珠对于副鸡禽杆菌具有较高的捕获率，高达90％以上；所制备的免疫磁珠具有较强的特异性，与其他常见食源性细菌无交叉反应；所制备的免疫磁珠敏感性好，当捕获体系中副鸡禽杆菌浓度低至102cfu/ml时，免疫磁珠的捕获率仍在80％以上。