一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用

本发明属于分子生物学、基因工程，涉及高产菌株的选育、中间载体的构建、利用抗性进行正向筛选、利用upp基因作为反向筛选、抑菌圈测活法测活、恩拉霉素的提取、液质联用检测鉴定，尤其是一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用。

背景技术：

1、恩拉霉素(enramycin)是从土壤微生物杀真菌链霉菌中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素，又名持久霉素，对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用，且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低等优势，而被广泛应用于家禽养殖业添加到动物的饲料中来促进动物的生长速度，不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。目前恩拉霉素的生产主要由杀真菌链霉菌(streptomyces fungicidicus)发酵获得。据世界卫生组织报道，由于抗生素的误用和过度使用，抗生素耐药性出现及发展的趋势开始加快，对疾病的感染预防和控制也越来越难，因此寻找新的抗生素迫在眉睫。脱卤素恩拉霉素衍生物或许能打破这一壁垒。

2、恩拉霉素的生产菌株是杀真菌链霉菌，为进一步简化放线菌的遗传操作流程，缩短重组菌株的筛选周期，在对杀真菌链霉菌进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)并通过对原始菌株中该基因的敲除，以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建，使用一套完整的基因编辑系统。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了2周左右，并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率，可实现对放线菌中目的基因的编辑。

3、目前针对放线菌的遗传育种方法主要有两种：一种为传统(物理/化学)诱变育种技术，即利用紫外诱变、化学诱变、微波诱变、太空诱变以及离子束诱变等技术对生产菌株进行诱变处理，然后通过大量筛选，获得生产性能更为优良的变异菌株。另一种放线菌的遗传育种方法为：现代分子生物学遗传育种技术，即通过对特定基因进行遗传改造来进一步提高菌株的生产性能。该方法可直接针对影响菌株产素水平的基因进行遗传改造，目的性更强，遗传操作也很简便。

4、随着分子生物学的快速发展，针对链霉菌等士壤微生物的遗传操作技术也得到了不断的发展和完善，并且建立了一整套完备的遗传转化方法和基因改造技术。然而随着高通量基因组测序技术的飞速发展以及大量基因组信息的积累和涌现，原有的单基因敲除技术已不能满足现代放线菌研究的需要。具体表现为：可用的筛选标记基因少、假阳性率高、敲除载体不易丢失等问题。再加上放线菌本身为多核细胞，生长周期较长，使得重组菌株的筛选工作尤为困难。因此，如何更快速、更高效地对链毒菌种进行改造,获得高产、高纯产物菌株成为目前链毒菌研究的一个主要目标。本发明upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了2周左右，并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率，可实现对放线菌中目的基因的编辑。

5、现有技术中脱卤素恩拉霉素衍生物制备的方法是通过敲除卤化酶基因获得，但是敲除大段基因会影响酶的结构从而对菌体造成未知的影响，因此本发明旨在采取移码突变的方法通过插入两个碱基的方式使卤化酶基因在翻译过程中提前终止，通过最少的改变使卤化酶失活，减少对菌体造成的影响。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法，步骤如下：

4、步骤1：确定恩拉霉素的卤化酶基因orf30，卤化酶基因orf30的基因序列为seq idno.1，卤化酶基因orf30的氨基酸序列为seq id no.2；

5、步骤2：筛选已经敲除了upp的高产菌株作为出发菌株；

6、步骤3：构建质粒，与链霉菌进行结合转移，移码突变出发菌株；

7、步骤4：对突变菌株进行发酵，对发酵液进行恩拉霉素的提取并且测活；

8、步骤5：通过液质联用鉴定，与原始出发菌株做对比，确定目标产物，得到脱卤素恩拉霉素衍生物。

9、进一步地，所述步骤1中通过文献及ncbi数据库查找的杀真菌链霉菌恩拉霉素合成基因簇，根据序列找到orf30基因序列，通过重叠pcr的方式在卤化酶基因中间插入两个碱基，使其发生移码突变，翻译提前终止。

10、进一步地，所述步骤2中，使用已经敲除的upp的杀真菌链霉菌，upp作为反向筛选标记可以缩短筛选周期，同时敲除该基因不会影响菌株正常生长，活性与原始菌株相似。筛选的步骤：对菌株进行活化，28℃培养4-6天后挖琼脂块上种子培养基摇床培养，48小时转接到发酵培养基。经过发酵培养七天后下发酵，离心后去上清，在沉淀中加入浸提液充分震荡混匀，浸提3.5h后，离心取上清，通过抑菌圈测活法，对其活性进行测量鉴定，并对活性高的菌株进行保存。

11、进一步地，所述步骤3中，将移码突变后的卤化酶基因构建在带有upp基因和红霉素启动子基因的pkc1139的质粒上，化转到et12567的大肠感受态细胞中，通过结合转移的方式将质粒导入杀真菌链霉菌中，进而通过单双交换的方法筛选出杀真菌链霉菌的基因组中卤化酶基因成功发生移码突变的菌株。

12、进一步地，所述步骤4中，利用步骤2中相同的发酵方法对突变后的菌株进行发酵及活性鉴定。

13、进一步地，所述步骤5中，通过对比出发菌株和突变菌株hplc-ms方法来区别鉴定物质。

14、如上所述的方法制备得到的脱卤素恩拉霉素衍生物。

15、本发明取得的优点和积极效果为：

16、1、本发明方法涉及到寻找恩拉霉素合成基因簇中卤化酶基因(orf30)，利用现代分子生物学遗传育种技术移码突变卤化酶基因，通过发酵测活及液相分析得到脱卤素恩拉霉素衍生物。脱卤素恩拉霉素衍生物作为本发明提供的制备脱卤素恩拉霉素衍生物流程图如图8所示。

17、2、本发明方法的具体步骤如下：确定恩拉霉素生物合成基因簇中卤化酶基因(orf30)，对卤化酶进行移码突变使其翻译提前终止，构建卤化酶移码突变菌株；对改造后的菌株进行纯化、富集培养、发酵、提取、液相分析等方法，确定脱卤素恩拉霉素衍生物的生成，并测定其活性得出与恩拉霉素活性相近。产生新的恩拉霉素衍生物，提供更多可能性。脱卤素恩拉霉素衍生物的优势主要体现在其对革兰氏阳性菌的强效抗菌活性，尤其是对产气荚膜梭菌的抑制力非常强，这有助于改善动物的肠道健康并促进生长。恩拉霉素衍生物在长期使用后不容易产生抗药性，这在抗生素使用中是一个显著的优势，因为它减少了耐药菌株的出现。此外，恩拉霉素在肠道内不被吸收，因此不会引起药物残留问题，这对于食品安全和公共卫生都是非常重要的。

18、恩拉霉素的衍生物还具有改善饲料利用率和促进动物增重的效果，这可以提高养殖业的生产效率和经济效益。由于其在饲料中具有很高的稳定性，即使在加工颗粒料过程中也能保持活性，这使得恩拉霉素成为饲料添加剂的理想选择。

19、在环境方面，恩拉霉素经动物粪便排出后对农作物、鱼类和环境无毒害作用，这表明它是一种安全、环保的动物专用抗生素。此外，恩拉霉素对乙肝病毒(hbv)抗原有较强的抑制作用，对乙肝e抗原(hbeag)也有较好的抑制效果，这可能为恩拉霉素在医药领域的应用提供了新的方向。

20、在工业应用方面，脱卤酶在化学工业和生物修复中具有潜在的应用价值，它们催化有机卤素化合物碳卤键断裂，这在环境技术中对于去除和解毒污染物非常重要。脱卤酶的这些特性为改进性能和潜在的微生物脱卤应用提供了新的可能性。

21、总结来说，脱卤素恩拉霉素衍生物的优势包括强效抗菌性、不易产生抗药性、无药物残留问题、提高饲料利用率和动物生产效率、环境友好性以及在工业上的潜在应用。这些特性使得恩拉霉素衍生物在农业和可能的医药领域具有广泛的应用前景。本发明方法通过结合了传统的重叠pcr技术以及生物信息学、现代分子生物学操作的方法，得到一种脱卤素恩拉霉素衍生物。