一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用

1.一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中通过文献及ncbi数据库查找的杀真菌链霉菌恩拉霉素合成基因簇，根据序列找到orf30基因序列，通过重叠pcr的方式在卤化酶基因中间插入两个碱基，使其发生移码突变，翻译提前终止。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，使用已经敲除的upp的杀真菌链霉菌，upp作为反向筛选标记可以缩短筛选周期，同时敲除该基因不会影响菌株正常生长，活性与原始菌株相似。筛选的步骤：对菌株进行活化，28℃培养4-6天后挖琼脂块上种子培养基摇床培养，48小时转接到发酵培养基。经过发酵培养七天后下发酵，离心后去上清，在沉淀中加入浸提液充分震荡混匀，浸提3.5h后，离心取上清，通过抑菌圈测活法，对其活性进行测量鉴定，并对活性高的菌株进行保存。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，将移码突变后的卤化酶基因构建在带有upp基因和红霉素启动子基因的pkc1139的质粒上，化转到et12567的大肠感受态细胞中，通过结合转移的方式将质粒导入杀真菌链霉菌中，进而通过单双交换的方法筛选出杀真菌链霉菌的基因组中卤化酶基因成功发生移码突变的菌株。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4中，利用步骤2中相同的发酵方法对突变后的菌株进行发酵及活性鉴定。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5中，通过对比出发菌株和突变菌株hplc-ms方法来区别鉴定物质。

7.如权利要求1至6任一项所述的方法制备得到的脱卤素恩拉霉素衍生物。