一种靶向FAP的CAR-T细胞在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种靶向fap的car-t细胞在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用。

背景技术：

1、心肌炎患者的慢性炎症会导致心肌纤维化，损伤后，活化的成纤维细胞会分泌大量纤维化因子和细胞外基质，积聚在心肌间质和血管周围间隙，重塑心肌。心肌纤维化是心肌间质的重塑过程，其特点是心肌组织间质成纤维细胞异常增殖、胶原纤维过度堆积、单位质量心肌的胶原浓度和体积分数显著增加，以及各类胶原比例失调和分布异常。其原因是肌成纤维细胞在慢性炎症反应下过度沉积细胞外基质蛋白，导致疤痕形成和组织硬化，心脏功能逐渐受损，最终导致心力衰竭。然而，临床上用于干预心肌炎的药物大多侧重于抗心力衰竭或心律失常，而不是纤维化过程，无法阻止和消除活化的成纤维细胞。

2、多种刺激可导致心肌纤维化的发生，包括非炎症途径和炎症途径，如肾素-血管紧张素-醛固酮系统途径和tgf-β途径。炎症导致的心肌损伤是心肌纤维化的重要原因之一。在慢性炎症过程中，以单核细胞和巨噬细胞为主的大量免疫细胞聚集和浸润，造成心肌损伤，同时分泌大量促炎介质，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-1，形成慢性炎症微环境。在这种细胞环境中，细胞因子和生长因子大量释放，包括转化生长因子-β家族成员和wingless/int-1，它们是纤维化过程的主要效应因子。tgf-β和wnt1与干细胞表面受体结合并启动下游信号传导，最终分别导致smad2/3和cbp/β-catenin转录调节因子。这导致靶基因表达上调，进一步加强了肌成纤维细胞的分化和胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的产生和分泌，从而促进了心肌纤维化过程。

3、目前临床治疗纤维化的重点是减轻慢性炎症、减少促炎症和促纤维化因子的分泌以及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的发展。这包括通过血管紧张素受体抑制剂或松弛素来抑制tgf-β和smad，调节基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂之间的平衡，从而治疗纤维化。然而，活化的肌成纤维细胞并不会就此止步，纤维化过程也不会中断。因此，亟需开发新的治疗策略来针对心肌炎慢性期的纤维化。

4、嵌合抗原受体t胞疗法(car-t)在肿瘤、自身免疫和白血病治疗领域取得了突破性进展。它从患者的免疫系统中提取t细胞，在体外培养和改造t细胞，使其具有识别和攻击特定癌细胞的能力，然后将改造后的t细胞注射回患者体内，t细胞对癌细胞的免疫反应会消灭癌细胞。美国食品和药物管理局已批准将car-t细胞疗法用于某些形式的白血病和淋巴瘤患者。最近的研究表明，car-t细胞疗法在实体瘤、自身免疫性疾病、慢性感染、心脏病和与衰老有关的疾病方面同样具有前景。因此，利用car-t细胞靶向非癌细胞是一种新的尝试。乔纳森-爱泼斯坦团队利用car-t细胞疗法治疗纤维化引起的心力衰竭取得了定量的良好效果，研究表明car-t细胞疗法能有效抑制angii诱导的心力衰竭模型小鼠的心肌纤维化过程。然而，car-t疗法目前能否应用于慢性炎症诱发的心肌纤维化尚不清楚。

5、因此，亟需开发一种针对心肌炎慢性期所致心肌纤维化的car-t疗法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向fap的car-t细胞在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用。本发明发现fap是心肌炎病理中靶向心脏成纤维细胞的潜在候选者，并开发了一种fap特异性car-t细胞(αfap-car-t)，αfap-car-t对心肌炎慢性期的纤维化治疗效果优异。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供以fap基因和/或fap蛋白作为作用靶点的物质在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用。

4、优选地，所述以fap基因作为作用靶点的物质是降低fap基因活性和/或表达量的抑制剂。

5、优选地，所述以fap蛋白作为作用靶点的物质是降低fap蛋白表达与功能的抑制剂，或靶向fap蛋白的抗体、靶向fap蛋白的car分子、靶向fap蛋白的car细胞。

6、优选地，所述抑制剂包括：小分子化合物、表达fap基因的干扰rna载体或fap基因敲低或者敲除体系的载体中任意一种或两种的组合。

7、优选地，所述载体包括：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、质粒、脂质体或纳米颗粒中任意一种或至少两种的组合。

8、优选地，所述靶向fap蛋白的car细胞包括：car-t、car-nk、car-nkt、car-m(car-巨噬细胞)、car treg或car-γδt中任意一种。

9、本发明中发现fap特异性car-t细胞能有效靶向表达小鼠fap蛋白的细胞，car-t细胞被激活后还能有效清除表达小鼠fap蛋白的细胞。

10、本发明还提供了靶向fap蛋白的car-t细胞在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用。

11、本发明开发了一种针对心肌炎慢性期所致心肌纤维化的car-t疗法。通过心肌炎患者、扩张型心肌病患者和健康人的rna测序数据，来确定心肌炎慢性期纤维化的特异基因和心脏纤维化的内源性靶点。通过构建car-t来表达针对靶点的嵌合抗原受体。随后，构建了实验性自身免疫性心肌炎(eam)模型和病毒性心肌炎模型(cvb9)，以模拟与炎症相关的慢性心肌纤维化。通过静脉将car-t定期注射到心肌炎小鼠体内，研究其治疗心肌炎慢性阶段心肌纤维化的效果。根据eam、cvb9小鼠心肌样本和人类心肌炎患者样本的研究结果，成纤维细胞活化蛋白(fap)是心肌炎慢性期患者中表达量最高的纤维化基因，其表达量与心脏纤维化程度相关。因此fap被选为心肌炎慢性期纤维化的标志物。表达靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体t细胞(αfap-car-t)能识别活化的心肌成纤维细胞，并显著减轻小鼠炎症损伤后的心脏纤维化并恢复功能。这种方法有效地减轻了小鼠心肌炎慢性期的心脏纤维化，并恢复了炎症损伤后的功能。这些发现为car-t在治疗心脏免疫相关疾病方面的发展提供了证据。

12、优选地，所述靶向fap蛋白的car分子特异性结合心脏成纤维细胞表达的fap蛋白，所述car分子的胞外识别结构域的氨基酸序列选自：

13、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或者如seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，具有结合fap功能的氨基酸序列。

14、优选地，所述car分子包括：信号肽、胞外识别结构域、跨膜结构域和信号传导结构域依次串联组成。

15、优选地，所述跨膜结构域为cd28铰链区和cd28跨膜区。

16、优选地，所述信号传导结构域为cd28信号内域和cd3z内域。

17、优选地，所述信号肽与胞外识别结构域之间还有flag标记。

18、优选地，所述car分子包括seq id no.10所示的氨基酸序列。

19、优选地，所述car-t细胞采用包括如下步骤的制备方法制得的：

20、构建表达载体，所述表达载体含有编码靶向fap的car分子的核酸分子；

21、将所述表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞得到重组慢病毒；

22、将所述重组慢病毒转染到t细胞中表达，得到car-t细胞，所述细胞表达靶向fap的car分子。

23、优选地，所述表达载体包括病毒载体。

24、优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为逆转录病毒载体。

25、优选地，所述编码靶向fap的car分子的核酸分子包括seq id no.9所示。

26、优选地，所述靶向fap的car分子的氨基酸序列包括seq id no.10所示。

27、第二方面，本发明提供一种靶向fap的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性结合心脏成纤维细胞表达的fap蛋白，所述嵌合抗原受体的胞外识别结构域的氨基酸序列选自：

28、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或者如seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，具有结合fap功能的氨基酸序列。

29、本发明中，所述如seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为具有至少95％同一性的氨基酸序列。

30、优选地，所述嵌合抗原受体包括：信号肽、胞外识别结构域、跨膜结构域和信号传导结构域依次串联组成。

31、优选地，所述跨膜结构域为cd28铰链区和cd28跨膜区。

32、优选地，所述信号传导结构域为cd28信号内域和cd3z内域。

33、优选地，所述嵌合抗原受体包括seq id no.10所示的氨基酸序列。

34、第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第二方面所述的靶向fap的嵌合抗原受体。

35、第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括至少一个拷贝的第三方面所述的核酸分子。

36、优选地，所述表达载体包括病毒载体。

37、优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为逆转录病毒载体。

38、第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用包括如下步骤的制备方法制得的：将第四方面所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞得到所述重组慢病毒。

39、第六方面，本发明提供一种靶向fap的嵌合抗原受体t细胞，所述嵌合抗原受体t细胞采用包括如下步骤的制备方法制得的：将第五方面所述的重组慢病毒转染到t细胞中表达，得到所述嵌合抗原受体t细胞，所述细胞表达第二方面所述的靶向fap的嵌合抗原受体。

40、本发明中，所述靶向fap的嵌合抗原受体t细胞的制备方法包括：

41、(1)构建编码靶向fap的嵌合抗原受体的表达载体；

42、(2)将步骤(1)中的表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；

43、(3)将步骤(2)中的重组慢病毒导入t细胞中，制备表达靶向fap的嵌合抗原受体t细胞。

44、第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的靶向fap的嵌合抗原受体t细胞。

45、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

46、第八方面，本发明提供第六方面所述的靶向fap的嵌合抗原受体t细胞和/或第七方面所述的药物组合物在制备治疗心肌炎慢性期心脏纤维化的药物中的应用。

47、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

48、(1)本发明发现fap的表达与纤维化程度呈正相关，fap是心肌炎病理中靶向心脏成纤维细胞的潜在候选者。

49、(2)本发明构建的fap特异性car t细胞(同“car-t细胞”)能有效靶向并裂解表达小鼠fap蛋白的细胞，αfap-car t对心肌炎慢性期的纤维化治疗效果优异。