基于核酸分子电子学的经修饰的腺嘌呤的制作方法

背景技术：

1、dna可以通过其螺旋结构传输电子，这使得dna在分子电子学领域成为有吸引力的分子线。dna具有均匀的一维结构(直径约2nm)、可编程自组装，故可以根据沃森-克里克(watson-crick)碱基配对规则(g与c配对，a与t配对)设计结构，并且其长度可从纳米级到微米级进行调节，精度达到埃级。

2、然而，dna的电导率取决于其序列，相较于鸟嘌呤-胞嘧啶(g-c)碱基对，胸腺嘧啶-腺嘌呤(t-a)碱基配对对会降低dna分子的电导率。尽管仅包含g-c碱基对的同质序列在电荷传输方面表现出相对较高的电洞迁移率，但由于分子长度及所需的高纯度，合成过程极为困难。此外，富含g-c的dna容易形成不必要的二级甚至四级结构，导致基于dna的分子装置的测量和组装复杂化。因此，提高用于dna分子线中的a-t碱基对的电导率是十分必要的。

技术实现思路

1、本技术总体上提供具有改善电导率的经修饰腺苷及其在例如dna分子线中使用经修饰a-t碱基对的方法。

2、一方面，本技术的特征在于一种包括导电或半导电分子线的系统，所述系统包含纳米结构，其包括一个或多个核酸碱基对，其中，所述纳米结构内至少有一个核碱基包括2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤或以下：

3、

4、另一方面，本技术的特征在于一种鉴定、表征或定序生物聚合物的系统，所述系统包括：由第一电极和第二电极形成的纳米间隙；具有两个末端的纳米结构，所述纳米结构包含一个或多个核酸碱基对，纳米结构桥接在电极之间的纳米间隙，其中，每个电极化学键合至纳米结构的其中一个末端，且纳米结构包括2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤；以及附接于纳米结构上的感测探针，所述探针能与生物聚合物相互作用或进行化学或生化反应。

5、另一方面，本技术的特征在于一种改善分子线电导率的方法，包括：提供分子线，所述分子线为包含一个或多个核酸碱基对的纳米结构；以及修饰至少一个核酸碱基为2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤。

6、另一方面，本技术的特征在于一种鉴定、表征或定序生物聚合物的方法。此方法包括：通过将第一电极和第二电极彼此靠近地放置在非导电基板上或通过彼此重叠并由非导电层隔开以形成纳米间隙；提供包含长度与所述纳米间隙相当的一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其中，所述纳米结构内的至少一个核酸碱基是2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤；将纳米结构的一端化学键结至第一电极，并将纳米结构的另一端化学键结至第二电极；以及附接感测探针到所述纳米结构上，其中，所述感测探针能够与所述生物聚合物进行物理上相互作用或进行化学或生化反应。

7、在上述各方面或其任何实施例中，所述分子线与电极电连接。

8、在上述各方面或其任何实施例中，所述分子线桥接两个电极之间的纳米间隙。

9、在上述各方面或其任何实施例中，所述分子线包括两个末端，各末端化学键结至所述电极的一者。

10、在上述各方面或其任何实施例中，所述电极的一者带正电而另一者带负电。

11、在上述各方面或其任何实施例中，所述电极设置在非导电基底上或由非导电层分隔。

12、在上述各方面或其任何实施例中，所述系统包括以下中的一个或多个：施加在第一电极和第二电极之间的偏压；记录通过纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动由感测探针和生物聚合物之间的相互作用所引起；以及识别或表征所述生物聚合物或所述生物聚合物的亚基的数据分析软件。

13、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米结构为核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构或其组合。

14、在上述各方面或其任何实施例中，所述生物聚合物包含天然的、合成的或修饰的dna、rna、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多醣或其类似物。

15、在上述各方面或其任何实施例中，所述感测探针是多核苷酸或多肽。

16、在上述各方面或其任何实施例中，所述感测探针是天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体或其组合。

17、在上述各方面或其任何实施例中，所述酶是天然的、突变的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna连接酶、dna外切核酸酶、逆转录酶、rna引子酶、核糖体、蔗糖酶或乳糖酶。

18、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米结构包含多肽。

19、在上述各方面或其任何实施例中，所述多肽是天然的、突变的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna连接酶、dna外切核酸酶、逆转录酶、rna引子酶、核糖体、蔗糖酶或乳糖酶。

20、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米间隙包括约3至1000nm、约5至100nm或约5至30nm。

21、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米间隙为5、10、20、25或30nm。

22、在上述各方面或其任何实施例中，所述电极含有铂(pt)、金(au)、银(ag)、钯(pd)、铑(rh)、钌(ru)、锇(os)、铱(ir)、铜(cu)、铼(re)、钛(ti)、铌(nb)、钽(ta)及其衍生物或其合金或组合。

23、在上述各方面或其任何实施例中，所述ta的衍生物是tin或tan。

24、在上述各方面或其任何实施例中，所述方法包括：在第一电极和第二电极之间施加偏压；提供记录通过纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动由感测探针和生物聚合物之间的相互作用引起；并提供识别或表征生物聚合物或生物聚合物亚基的数据分析软件。

25、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米结构为核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构或其组合。

26、在上述各方面或其任何实施例中，所述生物聚合物是天然的、合成的或修饰的dna、rna、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多醣或其类似物。

27、在上述各方面或其任何实施例中，所述感测探针是天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体或其组合。

28、在上述各方面或其任何实施例中，所述酶是天然的、突变的或合成的dna聚合酶、rna聚合酶、dna解旋酶、dna连接酶、dna外切核酸酶、逆转录酶、rna引子酶、核糖体、蔗糖酶或乳糖酶。

29、在上述各方面或其任何实施例中，所述纳米间隙的尺寸或两个电极之间的距离为约3至1000nm，优选约5至100nm，并且最优选约5至30nm。

30、在任何上述方面或其实施例中，电极含有铂(pt)、金(au)、银(ag)、钯(pd)、铑(rh)、钌(ru)、锇(os)、铱(ir)、铜(cu)、铼(re)、钛(ti)、铌(nb)、钽(ta)及其衍生物或其组合。

31、在任何上述方面或其实施例中，所述方法涉及：提供2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤三磷酸；并通过酶将2-氨基-7-脱氮-腺嘌呤三磷酸掺入纳米结构内的核酸链中。

32、本技术提供经修饰的腺苷。本技术定义的组合物和制品是单独或其它方式制造，与下列提供的实施例相关。本技术的其他特征和优点自详细说明和权利要求书中显而易见。

33、定义

34、除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本技术所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供本技术中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology(第二版，1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walker编辑，1988)；theglossary of genetics，第五版，r.rieger等人(编辑)。springer verlag(1991)；以及hale&marham，the harper collins dictionary of biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，以下术语具有下面赋予它们的含义。

35、术语“衔接子”是指例如通过连接添加至核酸的序列。衔接子的长度可以是约5至约100个碱基，并且可以提供定序引子结合位点(例如，扩增引子结合位点)和分子条形码，例如样品标识符序列或分子标识符序列，优选地是唯一识别符序列。衔接子可添加至核酸分子的1)5'末端、2)3'末端或3)两端。双链衔接子含有与核酸连接的双链末端。适配器可以具有悬垂部分或可以是钝端的。如下文将更详细描述的，可以通过仅将衔接子的一条链连接至片段来将双链衔接子新增至片段。可以使用聚合酶将衔接子的未连接链的序列加入片段。y型转接器和环形转接器是双链转接器的类型。

36、术语“改变”是指由例如本文所描述的标准领域已知方法所检测的核碱基或多核苷酸的结构、活性或传导特征的变化(增加或减少)。如本文所使用的，改变包括电导率的10％变化、25％的变化、40％的变化、50％％或更大的电导率变化。

37、术语“类似物”是指不相同，但具有类似的功能或结构特征的分子。

38、本文所用术语“反义链”是指与关注的目标核酸实质上或100％互补的多核苷酸。例如，反义链可以与mrna(信使rna)分子、非mrna的rna序列(例如microrna、piwirna、trna、rrna和hnrna)或编码或非编码的dna序列完全或部分互补。术语“反义链”和“引导链”在本文中可互换使用。

39、在本技术中，“包含”、“含有”和“具有”等术语具有美国专利法所赋予的含义，并且可以表示“包括”、“包含”等；“基本上由...组成”或“基本上由...构成”同样具有美国专利法中所赋予的含义，且所述术语是开放式，允许所列举者更多的内容存在，只要所列举者的基本或新颖特征不因所列举者以外的内容的存在而改变，但排除现有技术的实施例。

40、术语“互补”是指能够配对形成双链核酸分子或其部分。在一个实施例中，反义分子与目标序列大部分互补。互补性不需为完美的，而可以包括在1、2、3或更多个核苷酸处的错配。

41、术语“对应”是指包含双链基因的至少一个片段，使得双链抑制性核酸分子的一条链能与所述基因的互补链结合。

42、术语“降低”是指相对于参考水平降低至少约5％。减少可以是5％、10％、15％、20％、25％或50％，甚至可以多达75％、85％、95％或更多，以及任何中间百分比。

43、术语“检测”是指识别待检测分析物的存在、不存在的量或特征。在一些实施例中，所述分析物是经修饰的腺苷。在其他实施例中，使用本领域已知的方法检测所述经修饰的腺苷的电导率。

44、术语“可检测标记”是指当关注的分子连接时，使后者可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的组合物。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，常用于elisa中)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原(hapten)。

45、术语“dft(density functional theory)”是指计算分子结构和性质的密度泛函理论。在本技术中，使用市售软件spartan(wavefunction,inc.,usa)进行dft分析。具体而言，本技术的dft计算使用b3lyp/6-31g*方法，如spartan’20教程和用户指南(wavefunction,inc.,2022,downloads.wavefun.com/spartan20manual.pdf)中进一步描述者，其全部内容通过引用并入本文。

46、本文所使用的关于基因的术语“表达”或“表达的”是指所述基因的转录和/或翻译产物。细胞中dna分子的表达水平可以根据细胞内存在的相应mrna的量或由细胞产生的dna编码的蛋白质的量所确定(sambrook等，1989molecular cloning：a laboratory manual，18.1-18.88)。转染基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定地发生。在“瞬时表达”期间，转染基因在细胞分裂期间不会转移到子细胞。由于其表达仅限于转染细胞，因此所述基因的表达会随着时间的推移而丧失。相反，当所述基因与赋予转染细胞选择优势的另一种基因共转染时，可以发生转染基因的稳定表达。这种选择优势可能是对呈现给细胞的某种毒素的抗性。

47、术语“片段”指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选包含参考核酸分子或多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。

48、术语“高通量定序”是指允许对大量核酸进行定序的定序技术。

49、术语“杂交”是指互补核碱基之间的氢键，可以是沃森-克里克、胡斯坦(hoogsteen)或反向胡斯坦氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。

50、术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指在不同程度上脱离其天然状态下通常伴随的成分的材料。术语“分离”表示与原始来源或周围环境在某种程度上的分离。术语“纯化”表示高于分离的程度。术语“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他材料，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物特性或引起其他不良后果。也就是说，如果本技术的核酸或胜肽在通过重组dna技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品，则本技术的核酸或胜肽是纯化的。通常使用分析化学技术确定纯度和均匀性，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，这些蛋白质可以单独纯化。

51、术语“分离的多核苷酸”是指不含在本技术的核酸分子所源自的生物体天然存在的基因组中位于所述基因侧翼的基因的核酸(例如，dna)。因此，所述术语包括例如掺入载体中的重组dna；转化为自主复制的质粒或病毒；或进入原核生物或真核生物的基因组dna中；或作为独立于其他序列的单独分子(例如，经由pcr或限制性内切核酸酶消化产生的cdna或基因组或cdna片段)存在。此外，所述术语包括从dna分子转录的rna分子，以及作为编码附加多肽序列的杂合基因的一部分的重组dna。

52、术语“分离的多肽”是指已与其天然伴随的组分分离的本技术的多肽。通常，当多肽至少60％(按重量计)不含与其天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，所述多肽是分离的。优选地，所述制剂含有按重量计至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％的本技术的多肽。本技术的分离的多肽可以例如从天然来源提取、通过表达编码此类多肽的重组核酸来获得或通过化学合成蛋白质。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过hplc分析。

53、术语“分子线”是指能够传导电流的分子或分子结构。

54、术语“纳米间隙”是指两个物体之间的间隙，其尺寸在纳米级范围内。在一个实施例中，所述纳米间隙形成在两个电极之间。

55、术语“纳米结构”是指具有一维或多维的任何结构，其尺寸测量为纳米级范围内。

56、术语“rna-seq”指检测和定量生物样本中的rna分子的rna定序技术，其例如可用于研究细胞反应。相关术语“scrna-seq”是单细胞rna定序，例如，其可以是基于液滴的单细胞rna-seq或“drop-seq”，于本技术的实施例中是一种分析至少数十万个单独细胞中的rna表达的定序技术，但也可以使用任何其他高通量定序平台。

57、如本文所用，术语“获得”如在“获得试剂”中的使用，包括合成、购买或以其他方式取得所述试剂。

58、术语“减少”是指至少10％、25％、50％、75％或100％的负改变。

59、术语“参考”是指标准或控制条件。在一些实施例中，将包含一种或多种经修饰核碱基(例如，经修饰腺苷)的多核苷酸的电导率与不包含修饰核碱基或包含相较于对应多核苷酸较少的经修饰核碱基(例如，a-t)的参考多核苷酸(例如，dna分子)的电导率进行比较。

60、术语“参考序列”是用作序列比较基础的定义序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，全长cdna或基因序列的片段或完整的cdna或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或任意长度。

61、可用于本技术方法的核酸分子包括编码本技术多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常会表现出实质上的同一性。与内源序列具有“实质上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本技术方法的核酸分子包括编码本技术多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常会表现出实质上的同一性。与内源序列具有“实质上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下，互补多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间配对形成双链分子(参见例如wahl，g.m.和s.l.berger(1987)methods enzymol.152:399；kimmel，a.r.(1987)methods enzymol.152:507)。

62、例如，严格盐浓度通常小于约750mm氯化钠和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mm氯化钠和50mm柠檬酸三钠，更优选小于约250mm氯化钠和25mm柠檬酸三钠。低严格杂交可以在不存在例如甲酰胺的有机溶剂的情况下获得，而高严格杂交可以在至少约35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺存在下获得。严格的温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、最优选至少约42℃的温度。改变附加参数，例如杂交时间、例如十二烷基硫酸钠(sds)的去污剂的浓度以及载体dna的包含或排除，是本领域技术人员众所周知的。根据需要，通过组合这些不同的条件实现不同程度的严格性。在优选的实施例中，在30℃下，在750mm氯化钠、75mm柠檬酸三钠和1％的sds中进行杂交。在更优选的实施例中，在37℃下，在500mm氯化钠、50mm柠檬酸三钠、1％的sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子dna(ssdna)中进行杂交。在最优选的实施例中，在42℃下，在250mm氯化钠、25mm柠檬酸三钠、1％的sds、50％甲酰胺和200μg/ml变性鲑鱼精子dna(ssdna)中进行杂交。这些条件的有用变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。

63、对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格性也会有所不同。洗涤的严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或提高温度来提高洗涤的严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选小于约30mm氯化钠(nacl)和3mm柠檬酸三钠，且最优选小于约15mm氯化钠(nacl)和1.5mm柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施例中，洗涤步骤将在25℃下，在30mm氯化钠(nacl)、3mm柠檬酸三钠和0.1％的sds中进行。在更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃下，在15mm氯化钠(nacl)、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％的sds中进行。在最优选的实施例中，洗涤步骤将在68℃下，在15mm氯化钠(nacl)、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％的sds中进行。这些条件的附加变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如benton和davis(science 196:180,1977)；grunstein与hogness(proc.natl.acad.sci.,usa 72:3961,1975)；ausubel等人(current protocols in molecular biology，wiley interscience，new york，2001)；berger和kimmel(guide to molecular cloning techniques，1987，academic press，newyork)；sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual，cold spring harborlaboratory press，new york。

64、“基本上相同”是指多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)表现出至少50％同一性。优选地，这样的序列在氨基酸或核酸上与用于比较的序列至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％相同

65、序列同一性通常使用序列分析软件(例如，威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，1710university avenue,madison,wis.53705，blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)来测量。此类软件通过指定各种取代、删除和/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组别内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天门冬氨酸、麸氨酸、天门冬酰氨酸、麸酰氨酸；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙胺酸、酪胺酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其机率得分在e-3和e-100之间，指示紧密相关的序列。

66、本文所提供的范围应理解为所述范围内所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任何数字、数字的组合或子范围。

67、除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”应理解为包括在内。除非特别说明或从上下文显而易见，否则本文所使用的术语“一”、“一个”和“所述”应理解为单数或复数。

68、术语“载体”是指能够在宿主细胞中复制的核酸分子，例如质粒、黏粒、病毒或噬菌体。在一个实施例中，载体是表达载体，其是重组或合成产生的核酸构建体，带有一系列能够使核酸分子在宿主细胞中转录的特定核酸组件。通常，表达受某些调控组件的控制，包括组成型或诱导型启动子、组织偏好的调控组件和增强子。

69、除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可以理解为在10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内的规定值。除非上下文另有明确说明，本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

70、本文中变量的任何定义中的化学基团列表的列举包括所述变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文对变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单一实施例或与任何其他实施例或其部分组合的实施例。

71、本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。