蛋白质锚定方法、注射药物及其用途

本公开涉及生物医药领域，具体涉及一种蛋白质锚定方法、注射药物及其用途。

背景技术：

1、蛋白质药物是利用生物技术生产的具有生物活性的蛋白质制剂，通过特定的作用机制在机体内发挥治疗作用。

2、目前，所有蛋白质药物中仅有约15％酶类药物获得了美国食品药品监督管理局(fda)的批准。究其原因，虽然这些酶药物被用于治疗溶酶体贮积症、免疫缺陷、白血病、血友病b和血栓形成等众多疾病，并产生一定显著效果。但在药代动力学、药效学和安全性等方面，存在一定的壁垒，导致许多有潜力的酶药物候选物仍因效果不佳而在临床试验中失败。因此，通过延长半衰期、增加靶位积累和最大限度地降低免疫原性来改善酶药代动力学、药效学和安全性，以增加fda批准的酶药物的数量。

3、蛋白质局部锚定可以通过与细胞膜或其他细胞结构的相互作用，帮助蛋白质药物在机体内保持稳定的构象和活性。同时将蛋白质药物引导到特定的细胞或组织部位，实现精准定位。这对于治疗特定疾病或靶向特定细胞类型具有重要意义。现有技术中，主要利用糖结合蛋白(nature communications volume 9,article number:4943(2018))，将目的蛋白和g3(β-半乳糖苷聚糖结合蛋白)融合表达，g3可以和组织皮下细胞外基质中存在的大量糖胺聚糖(cag)紧密结合，实现目的蛋白在组织皮下的长期锚定。此外，将可以与细胞外基质(ecm)高亲和力结合的胎盘生长因子-2(pigf-2)的其中一个结构域融合在生长因子上，实现生长因子在注射部位的锚定，促进成骨修复和组织再生(science 2014,343,6173,885-888)。

4、现有技术中实现目的蛋白的锚定方式，需要在目的蛋白上融合表达外源糖结合蛋白或者细胞外基质结合蛋白，且通常在一周之内就被代谢完全，尤其在血流丰富、代谢旺盛的部位(如肌肉等)，通过糖结合蛋白g3进行锚定的策略，半衰期只有不到4个小时，完全达不到长效化的时间要求。因此锚定无法实现持久长效化。此外，很多酶对于结构的改变十分敏感，利用融合蛋白的策略进行锚定，可能会影响酶的活性，融合之后导致药物活性大大降低。

5、综上所述，目前，缺少一种不受组织部位聚糖成分的限制，可以实现长效锚定的方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本公开的目的在于解决现有技术中存在的问题至少之一，更确切地，本公开旨在提供一种蛋白质锚定方法，包括以下步骤：将1,2,4,5-四嗪化合物，或1,2,4,5-四嗪化合物的盐、溶剂合物或前药与基质蛋白结合；

2、加入反式环辛烯修饰的外源蛋白质，发生生物正交反应，以实现对外源蛋白质的共价锚定。

3、优选的，含有1,2,4,5-四嗪化合物包括修饰有交联基团的单取代1,2,4,5-四嗪分子，优选的，交联基团包括nhs-活性酯、酰氯或磺酰氟。

4、优选的，含有1,2,4,5-四嗪化合物包括结构通式如(式i)～(式viii)任一项所示的化合物:

5、

6、其中，ra为氢，rb、rc、rd、re、rf为任选的：

7、氢或苯基，

8、取代苯基，含有氢、卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基、烷酰基或炔基，

9、取代烷酰基，含有卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基或叠氮基，

10、未取代的烷酰基或炔基、酰基，

11、取代酰基，含有氢、卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基、烷酰基或炔基。

12、优选的，外源蛋白质的制备方法包括：

13、将含有外源蛋白基因的质粒转化到大肠杆菌中培养；

14、用异丙基-β-d硫代半乳糖苷(iptg)或阿拉伯糖(arabinose)诱导外源蛋白质表达，离心收集菌体沉淀；

15、将菌体沉淀纯化后，获得外源蛋白质。

16、优选的，反式环辛烯修饰的外源蛋白质由反式环辛烯-四聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯修饰外源蛋白质获得。

17、优选的，生物正交反应为：1,2,4,5-四嗪化合物与反式环辛烯进行的狄尔斯-阿尔德环加成反应；具体的，1,2,4,5-四嗪分子的亲双烯部分与反式环辛烯的双键发生狄尔斯–阿尔德环加成反应加成，生成的二氢哒嗪中间体不稳定，进一步环加成反应消除氮气，形成稳定的最终产物，反应式如下：

18、

19、其中，r为(式i)～(式viii)化合物中ra对位取代基。

20、优选的，基质蛋白包括来自哺乳动物皮下、关节下、肌肉组织部位的基质蛋白。

21、优选的，外源蛋白选自α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、c-x-c趋化因子、t39765、nap-2、ena-78、gro-a、gro-b、gro-c、ip-10、gcp-2、nap-4、sdf-1、pf4、mig、降钙素、c-kit配体、细胞因子、cc趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、rantes、i309、r83915、r91733、hcc1、t58847、d31065、t64262、cd40、cd40配体、c-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、mip-16、mip-1、表皮生长因子、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素、去角质毒素、因子ix、因子vii、因子viii、因子x、成纤维细胞生长因子、纤维蛋白原、纤连蛋白、四螺旋束蛋白、g-csf、glp-1、gm-csf、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子、水蛭素、人体生长激素、人血清白蛋白、icam-1、icam-1受体、lfa-1、lfa-1受体、胰岛素、胰岛素样生长因子、igfi、igf-ii、干扰素、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、角质细胞生长因子、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经生长因子、中性粒细胞抑制因子、制瘤素m、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、pd-ecsf、pdgf、肽激素、多效生长因子、蛋白a、蛋白g、pth、致热外毒素a、致热外毒素b和致热外毒素c、pyy、松弛素、肾素、scf、小的生物合成的蛋白质、可溶性补体受体i、可溶性i-cam 1、可溶性白介素受体、可溶性tnf受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、sea、seb、sect、sec2、sec3、sed、see、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体、vla-4蛋白、vcam-1蛋白、血管内皮生长因子、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、ldl受体、皮质酮中的至少一种。

22、在本公开的另一方面，提供了一种注射药物，包括修饰有交联基团的单取代1,2,4,5-四嗪化合物，优选的，交联基团包括nhs-活性酯、酰氯或磺酰氟；优选的，注射药物用于锚定后续注射于相同部位的蛋白类药物，其中，优选的，蛋白类药物是被反式环辛烯修饰的。

23、优选的，注射药物，包括结构通式如(式i)～(式viii)任一项所示的化合物:

24、

25、其中，ra为氢，rb、rc、rd、re、rf为任选的：

26、氢或苯基，

27、取代苯基，含有氢、卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基、烷酰基或炔基，

28、取代烷酰基，含有卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基或叠氮基，

29、未取代的烷酰基或炔基、酰基，

30、取代酰基，含有氢、卤素、碳原子数为1～7的烷基、碳原子数为1～7的取代烷基、碳原子数为1～7的烷氧基、叠氮基、烷酰基或炔基；

31、或(式i)～(式viii)任一项所示化合物的盐、溶剂合物或前药。

32、本公开进一步提供了一种蛋白质锚定方法用于原位交联、生物正交反应、生物分子标记、药物递送、蛋白质功能调控用途。

33、本公开进一步提供了一种1,2,4,5-四嗪化合物用于原位交联、生物正交反应、生物分子标记、药物递送、蛋白质功能调控用途。

34、本公开进一步提供了一种1,2,4,5-四嗪化合物用于用于锚定蛋白质的用途，优选的，蛋白质是被反式环辛烯修饰的蛋白质。

35、本公开进一步提供了一种注射药物用于原位交联、生物正交反应、生物分子标记、药物递送、蛋白质功能调控用途。

36、本公开的技术方案能够产生以下有益效果：

37、1.本公开所提供的1,2,4,5-四嗪的化合物可用于原位交联，是非常适用于体内生物正交反应的分子，且用于体内生物正交反应能够缩短反应时间、交联产物的长期有效性、提高生物利用度。

38、2.本公开所提供的蛋白质锚定方法可以将任意蛋白质通过两步法锚定在任意部位，进一步拓宽了蛋白质在生物医学领域的应用范围，也实现了蛋白质快速共价锚定、在部位长期积累以及长效驻留，并且能够阻止抗体的清除。

39、3.相较于非共价的锚定方法，本公开提供的蛋白质锚定方法在锚定时间和普适性均优于现有技术，且无需融合其他外源蛋白，不受组织部位聚糖成分的限制，通过简单的一步反式环辛烯-四聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯(tco-peg4-nhs ester)修饰即可在所有野生型蛋白质上修饰上反式环辛烯(tco)，从而进行任意注射部位的蛋白锚定。