靶向敲除HLA-G异构体基因的基因编辑系统和应用的制作方法

本发明属于基因工程，具体涉及靶向敲除hla-g异构体基因的基因编辑系统和应用。

背景技术：

1、人类白细胞抗原-g(human leukocyte antigen-g，hla-g)属于非经典的hla i类分子，该基因位于第6号染色体6p21.3区，全长约6.0kb。hla-g初始转录物经选择性剪接后至少产生7种信使rna(messengerrna,mrna)，分别编码如图1所示的至少7种蛋白质异构体分子，包括4种膜结合型hla-g1～-g4和3种可溶性hla-g5～-g7，以及新型的hla-g异构体等。

2、在图1所示的蛋白质翻译过程中，hla-g mrna第1外显子编码信号肽(signalpeptides,sp)，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3结构域，第5位外显子编码跨膜区(transmembrane region,tm)；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的hla-g分子胞内段；由于外显子6内含有终止密码子(tga)，第7、第8外显子对应于hla-g基因的非翻译区(3′-untranslatedregion,3′utr)。

3、hla-g1是由全长hla-g mrna编码，结构上类似于hlai类抗原，包含α1、α2、α3结构域。hla-g2缺乏α2结构域。hla-g3缺乏α2和α3结构域。hla-g4缺乏α3结构域。hla-g5及hla-g6胞外区结构域分别与hla-g1及hla-g2相同，但它们由含有内含子4的hla-g mrna编码，因内含子4中含有终止密码子(taa)，所编码的蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性hla-g分子。编码hla-g7的mrna由于内含子2中含有终止密码子(taa)，胞外区仅含α1结构域及由内含子2所编码的2个氨基酸残基相连。hla-g1～-g7等异构体的分子量约为39kd、31kd、23kd、30kd、37kd、27kd及17kd等。

4、相对于经典的hlai类分子，hla-g具有独特的启动子区域、基因多态性有限、严格的组织分布以及提呈抗原种类单一等特点。生理条件下，hla-g分子限制性分布于免疫豁免组织，如母胎界面的绒毛外滋养层细胞、胸腺、角膜、胰岛等。临床上，发现hla-g在病理组织中如肿瘤、器官移植、自身免疫疾病、炎症、病毒感染等特异性表达上调；且hla-g表达量高低与肿瘤患者的临床分期、预后、生存时间等密切相关。功能上，hla-g是机体内一种重要的免疫耐受分子，可通过抑制免疫细胞功能或诱导调节性细胞的产生，使肿瘤细胞逃逸宿主的免疫监视，进而导致肿瘤发生。

5、近几年，hla-g逐渐被认为是一种新型的免疫检查点分子，推断hla-g检查点抑制剂与化疗、放疗或其他免疫靶点药物的联合治疗将会给复发转移性肿瘤患者带来更好的疗效。目前，针对hla-g开发的抗体或car-t药物等尚处于早期的研究阶段。而针对hla-g功能，大多数的研究主要集中在全长的膜结合型分子hla-g1及其可溶性分子hla-g5，有关其他几种hla-g异构体分子的研究甚少，却与肿瘤进展密切相关，如肾癌、胃癌等。根据不同的研究，hla-g异构体在肿瘤发生中的作用仍存在争议。再加上，在不同肿瘤组织细胞中，发现不同的hla-g异构体表达存在广泛的异质性。因此，不同的hla-g异构体可能具有特定的生物学功能及其临床意义，使得研究除hla-g1、-g5之外的hla-g异构体分子功能迫在眉睫。

6、目前除了hla-g1、-g5异构体分子的生物学功能有被报道之外，hla-g2、-g3、-g4、-g6、-g7异构体分子，包括新型hla-g异构体分子的功能及意义仍未阐明。但是，目前尚未见通过何种技术成功对不同的hla-g异构体基因实现精准敲除的报道。

技术实现思路

1、本发明提供了靶向敲除hla-g异构体基因的基因编辑系统和应用，可以精准敲除不同的hla-g异构体基因或者完整性敲除整个hla-g基因，达到精准敲除hla-g特定基因区域的目的。

2、本发明提供了敲除hla-g异构体基因的sgrna组合，包括分别针对hla-g异构体基因的基因结构设计的靶标序列和互补序列；

3、所述基因结构包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子4和内含子2。

4、优选的，所述靶标序列和互补序列的核苷酸序列依次如seq id no.1～seq idno.14所示。

5、本发明提供了靶向敲除hla-g异构体基因的crispr/cas9载体组合，包括由上述sgrna组合中针对各基因结构设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与基因编辑载体连接构建得到的crispr/cas9载体。

6、优选的，所述基因编辑载体包括plenticrisprv2基因重组质粒。

7、本发明提供了一种敲除hla-g异构体基因的试剂盒，包括上述sgrna组合，或上述crispr/cas9载体组合。

8、优选的，利用所述试剂盒敲除整个hla-g基因时，所述crispr/cas9载体组合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4、plenticrisprv2-e5、plenticrisprv2-i2和plenticrisprv2-i4；

9、其中，plenticrisprv2-e1为将针对外显子1设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

10、plenticrisprv2-e2为将针对外显子2设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

11、plenticrisprv2-e3为将针对外显子3设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

12、plenticrisprv2-e4为将针对外显子4设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

13、plenticrisprv2-e5为将针对外显子5设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

14、plenticrisprv2-i2为将针对内含子2设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到；

15、plenticrisprv2-i4为将针对内含子4设计的靶标序列和互补序列退火后形成的双链序列与plenticrisprv2载体连接后构建得到。

16、优选的，利用所述试剂盒敲除膜结合型hla-g1基因的载体组合包括：plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

17、利用所述试剂盒敲除膜结合型hla-g2基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

18、利用所述试剂盒敲除膜结合型hla-g3基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-e5；

19、利用所述试剂盒敲除膜结合型hla-g4基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3和plenticrisprv2-e5；

20、利用所述试剂盒敲除可溶性hla-g5基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

21、利用所述试剂盒敲除可溶性hla-g6基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-i4；

22、利用所述试剂盒敲除可溶性hla-g7基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e1、plenticrisprv2-e2和plenticrisprv2-i2。

23、优选的，利用所述试剂盒敲除缺失α1的hla-g基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e3、plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5；

24、利用所述试剂盒敲除缺失α1和α2的hla-g基因的载体组合包括:plenticrisprv2-e4和plenticrisprv2-e5。

25、本发明还提供了靶向敲除hla-g异构体基因的crispr/cas9慢病毒试剂盒，包括靶向敲除不同hla-g异构体基因的crispr/cas9慢病毒系统；

26、所述crispr/cas9慢病毒系统的制备方法，包括分别使用慢病毒包装质粒对上述crispr/cas9载体组合中的每个crispr/cas9载体进行包装，转染人源细胞后，得到靶向敲除不同hla-g异构体基因的crispr/cas9慢病毒系统。

27、本发明还提供了上述sgrna组合、上述crispr/cas9载体组合、上述试剂盒或上述crispr/cas9慢病毒试剂盒在制备以hla-g为治疗靶点的药物中的应用。

28、有益效果：本发明依据人的hla-g基因序列设计得到可精准靶向hla-g基因的第1外显子(sp)、第2外显子(α1)、第3外显子(α2)、第4外显子(α3)、第5外显子(tm)、第2内含子以及第4内含子的一段引导rna(small guide rna,sgrna)。

29、本发明通过针对hla-g基因的各结构的靶序列和互补序列经退火后形成双链片段，将所述双链片段插入到基因编辑载体中，构建得到针对整体hla-g基因、膜结合型hla-g1～-g4基因、可溶性hla-g5～-g7基因以及新型hla-g基因的crispr/cas9基因编辑载体组合。

30、本发明结合慢病毒载体的高效转染特性和crispr/cas9技术的高效基因编辑特征，利用慢病毒对所述crispr/cas9基因编辑载体组合分别进行包装，可实现精准敲除不同的hla-g异构体基因或者完整性敲除hla-g基因，包括新型异构体，本发明为今后探索不同hla-g异构体分子的功能，和推动hla-g免疫抑制剂的研发及其在免疫治疗效果评价中均具有非常重要的意义。