一种融合蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及基因工程，涉及一种融合蛋白及其制备方法；尤其涉及一种抗猪流行性腹泻病毒的融合蛋白及其制备方法。

背景技术：

1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是一种单股正链rna病毒，属于冠状病毒科，α-冠状病毒属。其病毒粒子形态呈圆形或多边形，直径范围为90～190nm，平均直径130nm。pedv的病毒粒子由四个主要结构组成，分别是外膜蛋白(m蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)和纤突蛋白(s蛋白)。

2、猪流行性腹泻病毒可导致猪引起一种病毒性疾病猪流行性腹泻(porcineepidemic diarrhea，ped)，引起猪的腹泻、呕吐、食欲不振等症状。pedv可通过粪便、呼吸道分泌物等途径传播，病毒颗粒在环境中具有较强的稳定性，容易在猪场等集约化养殖场所传播。pedv对幼猪的影响尤其严重，感染后的幼猪易出现腹泻、呕吐等症状，病死率较高。目前，针对pedv的疫苗已经开发出来，但是pedv的变异性较大，疫苗的研发和应用仍面临一定的挑战。目前市面上的疫苗以灭活疫苗和弱毒活疫苗为主，因为传统疫苗存在毒力返强、灭活不彻底等安全问题，所以长期使用传统疫苗为pedv在田间不断重组变异提供了有利条件，致使其保护力逐年降低。由于猪流行性腹泻病毒的s蛋白表达量低，重组亚单位疫苗的研究和生产也面临极大的阻碍和挑战。如何开发一种高效、安全、低成本的新型疫苗成为领域内极受关注的问题。

技术实现思路

1、为了研究一种可有效预防猪流行性腹泻病毒的亚单位疫苗，并使该疫苗具有较高的免疫原性和稳定性，本发明提出了一种融合蛋白及其制备方法；具体是提供一种能稳定高效表达猪流行性腹泻病毒全长s蛋白的亚单位融合蛋白rsmut2-his及其在cho或293t细胞系统中构建和表达方法，该蛋白形成三聚体的比例可以达95.2％。本发明针对猪流行性腹泻病毒s片段进行分析和突变，筛选了可显著增加蛋白稳定性、蛋白免疫原性和表达量显著提高的突变体，其序列如seq id no.3所示。本发明获得的可以分泌表达亚单位融合蛋白rsmut2-his的单克隆细胞株，其表达产量高达1.6g/l。在之前相关研究中，s蛋白全长表达量仅1g/l，我们通过优化，将s蛋白表达量提高了60％，由1g/l提高至1.6g/l。筛选的突变型rsmut2蛋白中和效价是野生型rs蛋白的2.37倍。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、<第一方面>

4、本发明提供以下重组融合蛋白，含有猪流行性腹泻病毒全长的野生型s单体蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、或，含有猪流行性腹泻病毒全长的突变型smut1单体蛋白，其氨基酸序列如seq idno.2所示；

6、或，含有猪流行性腹泻病毒全长的突变型smut2单体蛋白，其氨基酸序列如seq idno.3所示；

7、或，含有猪流行性腹泻病毒全长的突变型smut3单体蛋白，其氨基酸序列如seq idno.4所示；

8、作为一个实施方案，smut1或smut2或smut3的c端连接6×his标签。

9、作为一个实施方案，本发明提供以下重组(亚单位)融合蛋白：rs-his、rsmut1-his、rsmut2-his、rsmut3-his，优选rsmut2-his。

10、作为一个实施方案，所述重组融合蛋白rs-his为氨基酸序列如seq id no.5所示的蛋白。

11、作为一个实施方案，所述重组融合蛋白rsmut1-his为氨基酸序列如seq id no.6所示的蛋白。

12、作为一个实施方案，所述重组融合蛋白rsmut2-his为氨基酸序列如seq id no.7所示的蛋白。

13、作为一个实施方案，所述重组融合蛋白rsmut3-his为氨基酸序列如seq id no.8所示的蛋白。

14、作为一个实施方案，所述重组融合蛋白的表达系统包括但不限于哺乳动物细胞。

15、作为一个实施方案，所述哺乳动物细胞包括cho细胞、293t细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为cho细胞。

16、<第二方面>

17、本发明提供了一种重组融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

18、s1、将所述重组融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有重组融合蛋白编码基因的重组质粒；

19、如将rs-his融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有rs-his融合蛋白编码基因的重组质粒；

20、或将rsmut1-his融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有rsmut1-his融合蛋白编码基因的重组质粒；

21、或将rsmut2-his融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有rsmut2-his融合蛋白编码基因的重组质粒；

22、或将rsmut3-his融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有rsmut3-his融合蛋白编码基因的重组质粒；

23、s2、将所述重组质粒转染至细胞株中；

24、如将含rs-his融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；

25、或将含rsmut1-his融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；

26、或将含rsmut2-his融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；

27、或将含rsmut3-his融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；

28、s3、发酵培养、纯化，筛选出重组融合蛋白表达细胞株；

29、具体包括：发酵培养步骤s2所述瞬时表达的cho细胞，纯化后得到各重组融合蛋白；筛选出表达量高，免疫原性好的重组融合蛋白表达细胞株；

30、s4、通过培养、筛选、驯化步骤s3中筛选到的重组融合蛋白表达细胞株，得到高度表达的细胞株；

31、s5、发酵培养所述高度表达的细胞株，纯化后得到所述重组融合蛋白。

32、作为一个实施方案，步骤s1中，rs-his融合蛋白编码的基因序列如seq id no.9所示；rsmut1-his、rsmut2-his、rsmut3-his融合蛋白编码的基因序列分别如seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。

33、作为一个实施方案，步骤s1中，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体。优选地，所述真核表达载体包括pee6.4、pee12.4、pgl4.13、pcdna3.1，更优选地，所述真核表达载体为pcdna3.1。

34、作为一个实施方案，步骤s1中，所述细胞株为cho细胞株。用于表达重组(亚单位)融合蛋白rsmut2-his的细胞为cho细胞。优选地，所述cho细胞株包括dg44、dxb11、cho-k1或cho-s细胞株。更优选地，所述cho细胞株为cho-k1。

35、<第三方面>

36、本发明提供了一种cho细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2024年9月3日，保藏名称为中国仓鼠卵巢细胞slpcb07，保藏编号为cctcc no:c2024299。

37、<第四方面>

38、本发明提供了上述重组融合蛋白或cho细胞株在制备预防病毒性疾病猪流行性腹泻的疫苗中的应用。

39、<第五方面>

40、本发明提供了上述重组融合蛋白或cho细胞株在制备预防和/或治疗病毒性疾病猪流行性腹泻的药物中的应用。

41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

42、1)本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达猪流行性腹泻病毒全长s蛋白的重组亚单位融合蛋白rsmut2-his的cho细胞株，该细胞株表达重组亚单位融合蛋白rsmut2-his产量高达1.6g/l、易于纯化，细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到85％以上，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到95％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求，易于大规模生产。

43、2)本发明构建了rsmut2-his融合蛋白突变体，且本突变体相对于野生型的融合蛋白，免疫原性显著提高。

44、3)本发明构建的rsmut2-his融合蛋白tm值显著提高，其形成的三聚体蛋白比例高达95.2％。

45、4)另外，由于生产用的cho细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，生物安全高，没有病毒，不存在散毒的风险。