一种微操作机器人的载细胞微凝胶组装方法及应用

本发明涉及生物医学工程，尤其涉及一种微操作机器人的载细胞微凝胶组装方法及应用。

背景技术：

1、载细胞微凝胶组装技术是一种将细胞培养在微米尺度的凝胶载体中，并对形成的细胞球体(即载细胞微凝胶)进行组装和培养的方法。这种技术可以提供一种支架或基质，使得细胞可以在其中生长、扩增和相互作用。而基于细胞-细胞相互作用的载细胞微凝胶组装技术则是将不同类型的细胞分别载入到微凝胶中，使它们能够在这个微环境中相遇、交流和相互作用。

2、这种技术的背景可以追溯到细胞培养和组织工程领域的发展。传统的细胞培养技术通常是将细胞直接培养在培养皿或培养瓶中，这种方式难以模拟细胞在生物体内复杂的微环境和相互作用。而载细胞微凝胶组装技术则通过提供一种三维结构和细胞间距离的控制，更好地模拟了生物体内细胞的微环境，从而有助于研究细胞-细胞相互作用的机制和调控。微凝胶是组织工程中的多功能平台，能够模仿组织重复构建单元和工程细胞微环境。此外，微凝胶的组装可形成更大的支架，满足了干细胞研究、个性化疾病模型以及微型组织工程等领域对体外生成具有受控和空间组织异质性所具有的3d细胞微环境的需求，这一需求正日益增长。由于细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ecm)相互作用对于细胞和组织功能至关重要，因此对细胞微环境的精确控制对于制造仿生组织结构至关重要。此外，组装来自不同组的负载细胞可以在简化的条件下模拟复杂的体内过程，从而产生组织异质性。使用微组织作为构建块的生物制造比单个细胞具有显着的优势，因为微组织自组装更快、更高效，从而缩短了3d构建体的成熟时间。

3、由细胞间相互作用的微凝胶组装主要通过模具法实现，将细胞接种到微凝胶表面，或者允许细胞从充满细胞的微凝胶内迁移/增殖到表面，最后通过成型方法获得的宏观3d结构。例如，在单分散微凝胶的表面培养细胞，然后将细胞包被的微凝胶堆叠在模具中以触发细胞与细胞的相互作用。

4、但模具法将载细胞微凝胶置于特定形状的模具中，经过培养后，建立起细胞间的相互作用而组装在一起，这种方法存在一些限制。首先，固定模具形状可能限制了组装的灵活性和变化性，而且单一组装模式只能实现特定的结构。此外，为不同形状或尺寸的微凝胶定制模具可能增加成本和降低生产效率，特别是对于小批量或个性化生产而言。另外，模具法难以在组装过程中进行动态调整或修正，并且在复杂环境中的应用受到限制。

5、在上述组装过程中，位于不同微凝胶表面的细胞形成细胞-细胞连接，细胞培养基扩散穿过微凝胶之间的空腔以提供营养。而这种组装是细胞自发发生的，不需要额外的化学物质或外部刺激(例如紫外线或交联剂)，表明没有潜在的生物毒性风险。利用模具法对载细胞微凝胶进行组装的方法简单易行、成本低廉且适用于批量生产，然而受限于模具形状、尺寸和空间分辨率，难以实现复杂结构和精确的细胞位置控制。因此，尽管在资源有限的实验室环境下具有一定优势，但在需要更精确控制和复杂结构的研究需求下可能不够适用。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足，本发明提出了一种微操作机器人的载细胞微凝胶组装方法及应用，克服了模板法组装微凝胶的局限性，增加了组装的灵活性和变化性。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一方面，本发明提供了一种微操作机器人的载细胞微凝胶组装方法，所述组装方法，包括以下步骤：

4、制备多孔微凝胶，所述多孔微凝胶与不同类型的细胞共同培养，培养成细胞球体，所述细胞球体作为基本组装单元；

5、利用微操作机器人调整所述细胞球体的位置，通过所述细胞球体的细胞之间相互作用，将基本组装单元组装一起。

6、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述不同类型的细胞的数目为5×104个/ml。

7、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述载细胞微凝胶的粒径为300-500μm。

8、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述微操作机器人的数目至少为2个。

9、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述利用微操作机器人调整所述细胞球体的位置，具体步骤如下：

10、所述微操作机器人夹持微针，对微针的针尖在载物台上进行空间定位，所述微操作机器人使用所述微针将不同类型的细胞的载细胞微凝胶，培养成熟形成细胞球体，对所述细胞球体进行聚焦，不断调整位置，使所述细胞球体按需求在空间中分布。

11、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述制备多孔微凝胶，其制备方法，包括以下步骤：

12、将第一内流体容器同轴嵌套第一外流体容器，使用第一连接器进行密封，所述第一内流体容器的入口端为第一入口，所述第一连接器的入口为第二入口，所述第一入口注入内流体，所述第二入口注入外流体，混合形成第一前体溶液；

13、将第二内流体容器同轴嵌套第二外流体容器，使用第二连接器进行密封，所述第二连接器的入口端为第三入口，所述第二内流体容器与所述第一外流体容器同轴嵌套，且所述第二内流体容器的入口端用于注入所述第一前体溶液，所述第三入口注入连续流体，所述第二内流体容器的出口端用于混合所述第一前体溶液与所述连续流体，形成第二前体溶液；

14、所述第二前体溶液在剪切力作用下形成液滴，所述液滴经过紫外光照射，得到所述微凝胶。

15、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述第一入口注入内流体，所述第二入口注入外流体，混合形成第一前体溶液，所述外流体的成分预先加热发生分解，在所述第一前体溶液中形成气孔，并在混合中将气孔带入所述第二前体溶液，形成液滴，经过紫外光照射，得到所述微凝胶。

16、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述内流体的成分包括羧甲基纤维素钠溶液，所述外流体的成分包括水凝胶溶液，所述连续流体的成分包括玉米油。

17、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述羧甲基纤维素钠溶液具体为1％wt羧甲基纤维素钠溶解于dmem。

18、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述水凝胶溶液具体为8％wt的明胶甲基丙烯酰胺、0.4wt％的羧甲基纤维素钠和0.25wt％的苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，5wt％碳酸氢铵溶解于hepes缓冲液中。

19、在此技术方案的基础上，进一步优选地，所述玉米油具体为玉米油，加入了0.6wt％的司班。

20、第二方面，本发明还提供了一方面所述基于微操作机器人的载细胞微凝胶组装方法在细胞培养、药物释放或细胞成像中的应用。

21、与现有技术相比，本发明的技术效果主要是：

22、现阶段载细胞微凝胶的组装主要是基于模具法，相比于模具法，微操作机器人在载细胞微凝胶组装中具有明显优势。微操作机器人具备灵活性和可变性，能够适应不同形状和尺寸的微凝胶，而无需重新设计模具。其高精度和精确性使得能够实现微米级的组装，而自动化程度则提高了生产效率并减少了人为错误的风险。与模具法相比，微操作机器人可以在组装过程中进行实时调整和监控，此外，还可以调控微凝胶负载细胞的类型的密度，因此更适用于各种实验需求，包括在复杂环境中的应用。

23、同时还通过油包水包水形成液滴，两个水相发生相互作用，由于流体间粘度的差异，会发生流体的粘性不稳定性，高粘流体在低粘流体里汇流时，来自外流的粘性应力将作用于内流。因此，内部流体发生流动振荡并形成弯曲而不是膨胀，以最大限度地减少粘性耗散，这种现象称为粘性不稳定性。正是因为粘性不稳定性使得所制备的微凝胶具有内部螺旋通道，多孔微凝胶的多层次孔隙结构和内部螺旋通道结合，极大丰富了结构层次性，高比表面积为细胞生长提供了充足的生长空间和附着位点。

24、本发明通过利用细胞间的自组装能力或特定的生物材料性质，使微凝胶能够在自然状态下自行组装成所需的结构，实现了无需模具的组装过程。

25、同时，本发明可实现多尺度范围内的载细胞微凝胶组装，包括微米级到毫米级的组装结构，从而满足不同应用场景下对组装结构尺度的需求。

26、高通量组装技术：创新的技术实现了高通量的组装过程，通过微流控技术、自动化控制系统或并行操作，实现多个载细胞微凝胶的同时组装，提高了组装效率和产量。