快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法与流程

本发明涉及蛋白印记膜，具体地说，涉及快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法。

背景技术：

1、蛋白印记是一种用于检测、量化和验证蛋白质存在的常用技术，在进行蛋白印记的过程中，通常需要将蛋白质从凝胶中转移到一种固相支持物上，这个支持物就是所谓的“蛋白印记膜”；其中，蛋白印记膜是蛋白免疫印迹技术中使用的一种固相支持物，用于固定和检测从凝胶中转移出来的蛋白质。蛋白印记膜的主要功能是提供一个稳定的表面，使蛋白质能够附着在其上，并保持其空间结构和生物活性，以便后续的检测。

2、在高通量筛选实验中，需要在同一时间内处理大量的样本，在这种情况下，使用快速转移蛋白的蛋白印记膜可以大大提高工作效率，减少实验周期；由于，膜表面存在过多的非特异性吸附位点，这会降低检测的特异性和灵敏度，为确保样本的稳定性和实验结果的准确性，鉴于此，我们提出快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜，包括以下组分：聚偏二氟乙烯10-20重量份、n,n-二甲基甲酰胺溶剂85-100重量份、纤维素纳米晶增强剂3-5重量份、3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液1-2重量份、乙二胺溶液6-10重量份、过碘酸钠溶液6-10重量份和edc/nhs交联剂12-15重量份；

3、其中，edc/nhs交联剂为浓度为5mg/ml edc（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）和10mg/ml nhs（n-羟基琥珀酰亚胺）的混合物，且edc与nhs的摩尔比为1:1.2～1.5。

4、作为优选，所述3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液浓度0.8%-1.2% (v/v)。

5、作为优选，所述乙二胺溶液浓度0.6-0.8% (w/v)、过碘酸钠溶液浓度0.5-0.7%(w/v)。

6、另一方面，本发明提供了快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜的制备方法，用于上述中任意一项所述的快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜，所述改进型蛋白印记膜的制备方法如下：

7、制备聚偏二氟乙烯膜：

8、s1.1、分别称取聚偏二氟乙烯10-20重量份、n,n-二甲基甲酰胺溶剂85-100重量份和纤维素纳米晶增强剂3-5重量份；

9、并将纤维素纳米晶增强剂分散在部分n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，制备得到纤维素纳米晶悬浮液；

10、s1.2、将聚偏二氟乙烯溶解于剩余的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，制备得到聚偏二氟乙烯溶液；

11、s1.3、将纤维素纳米晶悬浮液加入到聚偏二氟乙烯溶液中，搅拌均匀直至完全分散；

12、s1.4、将混合好的溶液倒入模具中，通过浇铸法形成膜；

13、s1.5、将膜放置在烘箱中加热固化，直到溶剂完全挥发，得到聚偏二氟乙烯膜；

14、纤维素纳米晶（cnc）因其高长径比、大比表面积和优异的机械性能，可以增强膜的强度和稳定性；pvdf是一种具有高化学稳定性和良好蛋白吸附性能的聚合物；通过将cnc与pvdf混合，可以制备出具有更优性能的聚偏二氟乙烯膜。

15、对聚偏二氟乙烯膜进行表面改性：

16、s2.1、分别称取3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液1-2重量份、乙二胺溶液6-10重量份、过碘酸钠溶液6-10重量份和交联剂12-15重量份；

17、同时，通过氧等离子体处理来活化聚偏二氟乙烯膜表面；氧等离子体处理可以引入极性基团（如羟基和羧基），用于增加膜的亲水性和表面能，有利于后续的化学反应；

18、s2.2、将活化后的聚偏二氟乙烯膜浸泡至3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液中，持久浸泡并反应18-24h，在聚偏二氟乙烯膜表面引入环氧基团，为后续的胺基化和羧基化反应提供反应位点；

19、s2.3、将步骤s2.2经过环氧基团功能化的聚偏二氟乙烯膜浸入乙二胺溶液中，并在ph为9-11的条件下，浸泡12-16h，使乙二胺溶液中与环氧基团反应，生成伯胺基团（-nh2），增加了膜的正电荷密度，有利于蛋白的吸附；

20、s2.4、将经过步骤s2.3处理过的聚偏二氟乙烯膜浸入过碘酸钠溶液，将环氧基团氧化成羧基（-cooh），羧基具有较强的电荷密度，可以与蛋白的氨基形成稳定的离子键，提高蛋白的结合能力；

21、s2.5、将edc/nhs交联剂溶解在n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶剂中，得到edc/nhs溶液，将含有羧基的聚偏二氟乙烯膜浸泡在edc/nhs溶液中，活性酯与膜表面的氨基反应，形成酰胺键；

22、使用edc/nhs活化羧基，使其能够与膜表面的氨基或其他含有活泼氢的基团反应，形成稳定的酰胺键，进一步增强膜与蛋白的结合力；

23、s2.6、反应完成后，用水清洗聚偏二氟乙烯膜，去除未反应的edc/nhs和其他副产品；

24、最后，将聚偏二氟乙烯膜放置在烘箱中干燥，去除残留的溶剂和水分，得到改进型蛋白印记膜；

25、在膜表面引入羧基，并进一步通过edc/nhs活化来增强膜的功能性，使其能够更好地结合蛋白质；

26、具体的，通过纤维素纳米晶与pvdf的复合，以及膜表面的功能化改性，可以有效提高蛋白印记膜的性能，包括蛋白吸附能力、选择性和稳定性。

27、作为优选，所述s1.1中，纤维素纳米晶悬浮液浓度为2-3% (w/v)。

28、作为优选，所述s1.2中，聚偏二氟乙烯溶液浓度为15-20% (w/v)。

29、作为优选，所述s1.5中，在100-150°c温度下，持续固化3-4h。

30、作为优选，所述s2.1中，通过氧等离子体处理来活化聚偏二氟乙烯膜表面的具体步骤为：

31、将聚偏二氟乙烯膜放置在等离子体反应器内，关闭反应器，开始抽真空直至达到160-240 mtorr，开始通入高纯度氧气（氧气纯度为99.99%以上），氧气流量10-50 sccm，开启等离子体发生器，设置功率50-300瓦特，使氧气电离产生等离子体，设定处理时间30-45min，处理完成后，停止等离子体发生器，等待聚偏二氟乙烯膜冷却至室温，并缓慢引入空气恢复常压，取出经过处理的聚偏二氟乙烯膜；聚偏二氟乙烯膜表面应该被成功活化，增加了其表面的极性和反应活性，从而有利于后续的化学改性步骤。

32、作为优选，所述s2.5中，edc/nhs溶液中，edc/nhs交联剂与n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶剂的混合比例为2:1。

33、作为优选，所述s2.6中，聚偏二氟乙烯膜在40-60℃条件下，干燥16-18h。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果：

35、1、该快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法中，在制备聚偏二氟乙烯膜时，通过添加纤维素纳米晶增强剂，用于提高膜的强度和稳定性；并采用3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液对聚偏二氟乙烯膜进行表面改性，在聚偏二氟乙烯膜上引入胺基（-nh2）和羧基（-cooh），这些基团与蛋白质分子上的相反电荷基团形成静电相互作用，从而增强蛋白的吸附能力。

36、2、该快速转移蛋白的改进型蛋白印记膜及其制备方法中，使用乙二胺，在碱性条件下与环氧基团反应，生成伯胺基团（-nh2），通过碘酸钠将环氧基团氧化成羧基（-cooh），edc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和nhs（n-羟基琥珀酰亚胺）一起使用，将羧基(-cooh)和伯胺基(-nh2)连接起来形成酰胺键，减少了膜表面的非特异性吸附位点，提高了实验的特异性和灵敏度；

37、其中，edc用于激活羧基，使其成为良好的离去基团，nhs作为辅助试剂，与被edc活化的羧基反应，形成不稳定的nhs酯中间体，nhs酯中间体与伯胺基反应，形成稳定的酰胺键，可以减少非特异性吸附，提高实验的特异性和灵敏度。