一种基于免疫沉淀技术富集DNA甲基化片段的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种基于免疫沉淀技术富集dna甲基化片段的方法。

背景技术：

1、dna甲基化一般指基因组cpg中胞嘧啶5号碳位的甲基化状态。作为重要的表观遗传学调控机制，在发育、疾病进展中扮演着重要的作用。dna甲基化异常是癌症发生和发展的重要早期事件。

2、在正常人类的dna中，2％～7％的胞嘧啶被甲基化，其中cpg是最重要的甲基化位点，它在基因组中呈现不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化区域。在基因组的某些区域，如基因的promoter(启动子区)、5’utr(非翻译区)和第一个exon(外显子)cpg的序列密度非常高。一般情况下，启动子区dna高甲基化与基因沉默相关，而低甲基化则与基因的活化相关联。大量的研究表明，抑癌基因的失活与该基因的启动子区域cpg岛过度甲基化有直接联系，从而导致癌症的发生。

3、针对基因组甲基化分析，目前主要是通过亚硫酸盐处理的方式。采用重亚硫酸盐处理样本dna，将dna中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，经pcr扩增后进一步变成胸腺嘧啶，而原本甲基化c则保持不变，从而有效的将表观遗传变异转化为序列差异。但是，重亚硫酸盐转化法对dna处理的过程包括变性、脱氨基和脱磺酸基等步骤，dna先被变性成单链，然后经高温、高盐、酸性、碱性环境，遭遇冰火两重天，获得的转化dna的形态为单链为主，双链混合，片段缺刻、缺口损伤、尿嘧啶状态核苷酸。该过程一般会导致90％以上的dna模板丢失，大量的甲基化信息无法被后续流程检测到。同时，该方法在碱基转化处理时，存在序列转化不完全或转化过度的情况，从而产生人为偏倚，后续经pcr扩增会进一步放大，造成大量的数据浪费。为了降低偏倚发生，就需要投入更多的dna、降低pcr循环数并优化pcr扩增酶的效率。

4、甲基化dna免疫共沉淀技术(medip)的原理是由于哺乳动物的甲基化通常发生在cpg的胞嘧啶5号碳原子(5mc)上，所以可以通过能特异性结合5mc的5-甲基胞嘧啶抗体来对高甲基化的片段进行富集，而且由于5-甲基胞嘧啶抗体也可以对非cpg位点上的5mc进行识别，因此具有更高的特异性，这种方法避免了传统方法损失大，投入量多，数据浪费等弊端。但目前在国内尚无对应的试剂盒出现，全部依赖进口，价格昂贵，因此寻找优化或替代性的方法是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于免疫沉淀技术富集dna甲基化片段的方法，包括如下步骤：

2、s1.向待测样本中添加λdna作为dna甲基化保护剂，得到添加λdna的样本；

3、s2.将免疫沉淀缓冲液和添加λdna的样本混合后90-95℃孵育5-20min，结束后迅速冷却，得到混合液；

4、s3.将抗体和磁珠加入到步骤s2得到的混合液中，2-8℃孵育4-16个小时；

5、s4.瞬时离心后置于预冷的磁力架上，弃掉上清液；使用洗涤液清洗磁珠；

6、s5.用洗脱液洗脱dna，条件为50-60℃/15min，95-100℃/15min。

7、优选的，步骤s1中，dna甲基化保护剂中，甲基化λdna：非甲基化λdna的质量比为1:1；

8、优选的，添加λdna的样本中，cfdna与dna甲基化保护剂的质量比为1:10-1:40，其中cfdna的浓度不低于0.01ng/μl。

9、优选的，步骤s2中，混合时，免疫沉淀缓冲液和添加λdna的样本的体积比为(30-35)μl：(55-60)μl。

10、优选的，步骤s2中，免疫沉淀缓冲液包括0.1-0.2m磷酸钠溶液，1-2m氯化钠溶液，1％-5％曲拉通x-100。

11、优选的，步骤s3中，还包括磁珠的清洗步骤和抗体的稀释步骤：

12、磁珠的清洗步骤：取2-6μl10mg/ml的磁珠原液用十倍稀释的免疫沉淀缓冲液对磁珠进行清洗，至少清洗两次，最后一次采用20μl的十倍稀释的免疫沉淀缓冲液重悬，得到浓度为1-3mg/ml的磁珠悬液；

13、抗体的稀释步骤：将浓度为1mg/ml的5-甲基胞嘧啶抗体使用十倍稀释的免疫沉淀缓冲液进行10-100倍稀释，得到抗体浓度为0.01-0.1mg/ml的溶液。

14、优选的，步骤s3中，抗体、磁珠、步骤s2得到的混合液按照以下体积比混合：1:1:(15-20)。

15、优选的，步骤s3中，磁珠为igg磁珠。

16、优选的，步骤s3中，抗体为5-甲基胞嘧啶抗体。

17、优选的，步骤s4中，洗涤液包括十倍稀释的免疫沉淀缓冲液和高氯化钠盐浓度的免疫沉淀缓冲液；高氯化钠盐浓度的免疫沉淀缓冲液组分为0.01-0.02m磷酸钠溶液，1-4m氯化钠溶液，0.1％-0.5％曲拉通x-100。

18、优选的，步骤s5中，洗脱液包括0.01-0.1m tris-hcl、0.01-0.1m edta、0.001-0.1％sds、0.1-1mg/ml蛋白酶k。

19、有益效果

20、本发明针对人外周血游离dna低起始量特性，通过优化结合环境以及添加适量的修饰λdna作为dna甲基化保护剂，采用竞争性结合的方式，减少由于抗体自身原因所带来的非特异性结合，提高medip结合的特异性，降低非特异性。相对于bs方法，有效提高了甲基化基因的结合效率。本发明除了对外周血游离dna的高效特异甲基化片段富集产生了显著效果之外，还同样适用于临床组织样本如石蜡切片、癌组织等基因组dna的甲基化富集。

1.一种基于免疫沉淀技术富集dna甲基化片段的方法，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，dna甲基化保护剂中，甲基化λdna：非甲基化λdna的质量比为1:1；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s2中，混合时，免疫沉淀缓冲液和添加λdna的样本的体积比为(30-35)μl：(55-60)μl。

4.如权利要求1的方法，其特征在于，步骤s3中，还包括磁珠的清洗步骤和抗体的稀释步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s3中，抗体、磁珠、步骤s2得到的混合液按照以下体积比混合：1:1:(15-20)。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s3中，磁珠为igg磁珠。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s3中，抗体为5-甲基胞嘧啶抗体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，免疫沉淀缓冲液包括0.1-0.2m磷酸钠溶液、1-2m氯化钠溶液及1％-5％曲拉通x-100；

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s5中，洗脱液包括0.01-0.1m tris-hcl、0.01-0.1m edta、0.001-0.1％sds及0.1-1mg/ml蛋白酶k。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：