基于XRCC3与XPC基因分析卵巢癌早期筛查方法与流程

本发明涉及xxxxx，特别是涉及基于xrcc3与xpc基因分析卵巢癌早期筛查方法。

背景技术：

1、卵巢癌是女性生殖系统中最具致命性的恶性肿瘤之一，早期诊断对提高患者生存率至关重要，研究表明，dna修复机制的异常与多种癌症的发展密切相关，尤其是卵巢癌，xrcc3和xpc基因在dna修复中发挥关键作用，其中xrcc3参与同源重组修复，而xpc则在核苷酸切除修复中发挥重要作用，两者的基因多态性可能影响个体对dna损伤的修复能力，从而增加患卵巢癌的风险；

2、近年来，研究表明dna修复机制在卵巢癌的发生与发展中发挥着重要作用；dna修复基因如xrcc3和xpc在修复dna损伤中具有关键功能，涉及细胞对环境因素和内源性损伤的反应；xrcc3基因编码的蛋白质主要参与同源重组修复，负责修复双链dna断裂；而xpc基因编码的蛋白质则在核苷酸切除修复中发挥作用，负责识别并修复因紫外线和化学物质引起的dna损伤；

3、这些基因的多态性可能导致修复能力的变化，从而影响个体对癌症的易感性；例如，xrcc3基因的某些单核苷酸多态性(snp)已被证实与卵巢癌的发病风险相关；类似地，xpc基因的多态性也与多种癌症的发生密切相关；尽管已有研究探讨了xrcc3和xpc基因的多态性与卵巢癌之间的关系，但缺乏系统性的方法用于有效地检测这些多态性，以作为早期筛查的生物标志物；

4、现有的卵巢癌筛查方法多依赖于影像学检查和ca-125标志物检测，但这些方法在早期检测中的敏感性和特异性有限；

5、基于此，需基于xrcc3与xpc基因分析卵巢癌早期筛查方法。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：基于xrcc3与xpc基因分析卵巢癌早期筛查方法，包括以下步骤：

2、步骤一、从实验组-临床卵巢癌患者和对照组-其他良性疾病就诊患者中各收集外周血液样本40例，为xrcc3和xpc基因检测提供基础样本；

3、步骤二、使用dna提取试剂盒从收集到的血液样本中提取全基因组dna，使用dnaclean&concentrator tm-5试剂盒纯化，将抑制因子和污染物去除，再通过nanodrop紫外分光光度计测定dna浓度，同时使用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，筛选合格dna样本；

4、步骤三、准备22k human genome array芯片，所述芯片包含21522条oligo dna探针，其中特异性探针用于识别xrcc3基因的a4541g、a17893g、t241m位点以及xpc基因的ala499val、lys939gln位点，每条探针特异性识别一个人类基因转录本，将实验组-临床卵巢癌患者的mrna和正常对照组-其他良性疾病的mrna逆转录为cdna，将cdna作为探针与芯片上的xrcc3和xpc特异性探针进行杂交；

5、步骤四、对提取的dna样本定量分析，标准化至50ng/μl，所需芯片分析的dna样本量为200ng，在样本中加入0.1n naoh使dna变性为单链，便与芯片上的xrcc3和xpc基因特异性探针结合，随后，将中和后的样本加入全基因组扩增试剂，在37℃恒温条件下孵育过夜，使扩增后的dna总量达到初始上样量的2000-3000倍；

6、步骤五、扩增后的dna样本进行可控的酶解处理，使片段化过程不损害xrcc3和xpc基因的完整性，片段化后，通过加入异丙醇沉淀，4℃离心以富集片段化的dna，随后，在空气中干燥并重悬于杂交缓冲液中；

7、步骤六、将重悬于杂交缓冲液中的dna样本与已准备好的芯片杂交，置于杂交炉内反应过夜，此时，片段化的dna与芯片上xrcc3和xpc基因位点特异性探针的有效结合，芯片总共包含610000种微珠类型，其中每种微珠对应检测一个snp位点；

8、步骤七、清洗去除未杂交及非特异性杂交的dna，仅保留与xrcc3和xpc基因位点结合的dna，利用捕获到的dna在芯片上进行单碱基延伸反应，并在芯片上添加可检测的标签基团，以区分xrcc3和xpc基因中的不同样本的snp类型，将反应完成的芯片置于xc4试剂中包被，形成保护层以稳定xrcc3和xpc基因的检测信号；

9、步骤八、使用luxscan 10ka双通道激光扫描仪对芯片进行扫描，激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，生成高分辨率的图像，所得数据导入luxscan3.0图像分析软件，分析oc组织与正常组织之间的荧光信号强度和比值，使用12个管家基因进行均衡；

10、在数据分析中，所设定判定xrcc3和xpc基因差异表达的标准如下：

11、标准一：oc组织和正常组织的比值ratio需大于2.0或小于0.5，其基因表达变化在2倍以上，反映出显著的差异；

12、标准二：oc组织和正常组织信号其中之一强度需大于800，或二者均需大于200，且显性表达数据在所有样本中能够重复；

13、步骤九、在基因表达谱中选择xrcc3和xpc基因中ratio值差异显著的上调和下调基因各一条，利用rt-pcr技术验证，确认xrcc3和xpc基因在卵巢癌患者中的表达差异。

14、进一步优选的，所述步骤三中，所述mrna的逆转录反应采用cbcscript逆转录酶，以保证逆转录效率和cdna的完整性，通过将从实验组-临床卵巢癌患者和对照组-其他良性疾病就诊患者收集的mrna混合，并根据cbcscript逆转录酶的用户手册中提供的反应条件设置，包括适宜的温度和时间，在反应完成后，利用琼脂糖凝胶电泳法确认cdna的质量，通过比较cdna的条带大小与标准标记，以验证完整性。

15、进一步优选的，所述步骤四中，加入全基因组扩增试剂的浓度范围为1-5μl，并保持反应体系的体积在20-50μl，在扩增过程中采用热循环程序，包括以下阶段：

16、变性阶段：在95℃下保持30秒至1分钟，使dna双链完全分开；退火阶段：将温度降至55℃-65℃，保持30秒至1分钟，使引物与目标序列特异性结合；延伸阶段：将温度设定在72℃，保持时间为30秒至1分钟，利用taq dna聚合酶对目标序列进行扩增；

17、扩增结束后通过光度计测定扩增产物的浓度，所获得的dna样本量满足后续芯片分析所需的200ng标准。

18、进一步优选的，所述步骤五中，片段化后的dna样本需经过酶解处理，其酶的选择包括限制性内切酶或dna片段化酶，生成的dna片段在200-500bp范围内，在dna沉淀后，通过离心和洗涤去除未结合的试剂和酶，得到高纯度的片段化dna样本，并重悬于适当的杂交缓冲液中。

19、进一步优选的，所述步骤六中，片段化后的dna样本经过变性处理，使其转变为单链形式，此时，dna样本中的序列与芯片上位点特异的50个碱基探针进行退火结合，每个微珠bead上连接着不同的50个碱基序列，芯片总共包含610000种微珠类型，每种微珠对应检测一个snp位点。

20、进一步优选的，所述步骤七中，将芯片放入xc4试剂中进行包被，使芯片的表面包裹上一层粘性透明液体，在芯片外形成保护层。

21、进一步优选的，所述步骤八中，将经过杂交和延伸反应处理的芯片放入扫描仪中，通过激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光信号，并生成高分辨率的图像数据，所得的图像数据直接导入luxscan3.0图像分析软件处理与分析，提取每个样本的snp分型数据。

22、进一步优选的，所述步骤九中，根据目标基因的序列信息设计特异性引物，引物的tm值相近，在在rt-pcr反应中，设定初始变性温度为95℃，退火温度为60℃，延伸温度为72℃，每个循环设定为30秒，pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，确认扩增的特异性和大小，通过比较扩增产物的条带强度及位置，确认上调和下调基因的表达差异。

23、根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：

24、本发明采用snp基因芯片技术系统地研究xrcc3和xpc基因的多态性与卵巢癌发病之间的关系，通过高通量基因检测，能够高效识别与卵巢癌相关的特定多态性位点，从而为卵巢癌的早期筛查提供更为精准的生物标志物，此外，本发明的实施方法确保了样本的高质量获取和数据分析的准确性，具有操作简便、重复性好、灵敏度高优点，通过xrcc3和xpc基因的特定多态性位点，有助于早期诊断卵巢癌。