多尾和多帽mRNA及其用途的制作方法

1.一种经修饰的mrna，其包括：

2.根据权利要求1所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，所述5'帽区包括一个5'帽。

3.根据权利要求1所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括一个poly-a尾，所述5'帽区包括两个或更多个5'帽。

4.根据权利要求1所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，所述5'帽区包括两个或更多个5'帽。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna包括5'非翻译区(5'utr)和3'非翻译区(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr与所述3'utr之间，其中所述3'utr位于所述orf与所述poly-a区之间，并且其中所述5'utr位于所述5'帽区与所述orf之间。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna是线性mrna，其中所述5'帽区位于所述经修饰的mrna的5'端处，并且所述poly-a区位于所述经修饰的mrna的3'端处。

7.根据权利要求5或6所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna是环状mrna，其中所述poly-a区位于所述3'utr与所述5'帽区之间。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，并且所述poly-a尾的至少两个实例通过第一接头共价连接。

9.根据权利要求8所述的经修饰的mrna，其中：

10.根据权利要求9所述的经修饰的mrna，其中n1的每个实例是1。

11.根据权利要求10所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例与所述第一poly-a尾的内部核苷酸共价连接。

12.根据权利要求10或11所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例在第二poly-a尾的3'核苷酸处与所述第二poly-a尾共价连接。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例包括通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分。

14.根据权利要求13所述的经修饰的mrna，其中通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分具有下式：

15.根据权利要求10至14中任一项所述的经修饰的mrna，其中：

16.根据权利要求10至15中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的经修饰的mrna，其中：

18.根据权利要求10至17中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例具有下式：

19.根据权利要求9所述的经修饰的mrna，其中n1的每个实例独立地是介于2与20之间，包含端值，的整数。

20.根据权利要求19所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例包括树枝状大分子。

21.根据权利要求20所述的经修饰的mrna，其中所述树枝状大分子的至少一个实例是聚酰胺胺(pamam)树枝状大分子。

22.根据权利要求21所述的经修饰的mrna，其中所述pamam树枝状大分子的至少一个实例具有下式：

23.根据权利要求22所述的经修饰的mrna，其中所述pamam树枝状大分子的至少一个实例包括：

24.根据权利要求21所述的经修饰的mrna，其中所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

25.根据权利要求24所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例具有下式：

26.根据权利要求8至25中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例与所述第一poly-a尾的3'核苷酸共价连接。

27.根据权利要求8至26中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例与所述第二poly-a尾的3'核苷酸共价连接。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna的所述poly-a区包括一个或多个经修饰的核苷酸。

29.根据权利要求28所述的经修饰的mrna，其中所述两个或更多个poly-a尾中的至少一个poly-a尾的最后10个核苷酸中的3个或更多个核苷酸是经修饰的核苷酸和/或非腺苷核苷酸。

30.根据权利要求28或29所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸是经修饰的腺苷核苷酸。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸是经修饰的非腺苷核苷酸。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的核碱基。

33.根据权利要求32所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的核碱基选自由以下组成的组：黄嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黄嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鸟嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氢-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-甲酰基尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-鸟嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、阿糖腺嘌呤(araadenine)、阿糖胞嘧啶(aracytosine)、阿糖鸟嘌呤(araguanine)、阿糖尿嘧啶(arauracil)、生物素-16-7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脱硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脱硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、异鸟嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鸟嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鸟嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黄苷、3-脱氮杂腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鸟嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-异戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-异戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(g6a)、n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(t6a)、2-甲基硫代-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(m6t6a)、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(hn6a)、2-甲基硫代-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙酰基腺嘌呤(ac6a)。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的糖。

35.根据权利要求34所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的糖选自由以下组成的组：2'-硫代核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-氨基-2'-脱氧核糖、2'脱氧核糖、2'-叠氮基-2'-脱氧核糖、2'-氟-2'-脱氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脱氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脱氧核糖、3'-叠氮基-2',3'-二脱氧核糖、3'-脱氧核糖、3'-o-(2-硝基苄基)-2'-脱氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脱氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亚甲基连接的核糖、2'-o,4'-c-氨基连接的核糖和2'-o,4'-c-硫代连接的核糖。

36.根据权利要求28至35中任一项所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的磷酸酯。

37.根据权利要求36所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的磷酸酯选自由以下组成的组：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羟基膦酸酯、羟基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯(carbophosphonate)、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍环、三唑环、硼磷酸酯(boranophosphate，bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

38.根据权利要求36或37所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个硫代磷酸酯。

39.根据权利要求38所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括5至30个硫代磷酸酯。

40.根据权利要求28至39中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个脱氧核糖。

41.根据权利要求40所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括5至30个脱氧核糖。

42.根据权利要求28至41中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、二脱氧鸟苷、二脱氧胸苷、二脱氧尿苷或反向脱氧胸苷。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括25至500个核苷酸。

44.根据权利要求43所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500个核苷酸。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区包括所述poly-a区包括10个或更多个腺苷核苷酸。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述poly-a区的核苷酸的25-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％、96-100％、97-100％、98-100％或99-100％是腺苷核苷酸。

47.根据权利要求8至46中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸、1至10个包括连接点的经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸和3'末端双脱氧核糖核苷酸或反向脱氧核糖核苷酸；并且所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸。

48.根据权利要求47所述的经修饰的mrna，其中：

49.根据权利要求47或48所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的尿苷脱氧核苷酸是5-辛二炔基脱氧尿苷。

50.根据权利要求8至46中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸和3'末端叠氮化物部分。

51.根据权利要求50所述的经修饰的mrna，其中所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：

52.根据权利要求8至46中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸和5'末端叠氮化物部分。

53.根据权利要求52所述的经修饰的mrna，其中所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：

54.根据权利要求1至53中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括两个或更多个5'帽，并且所述5'帽的至少两个实例通过第二接头共价连接。

55.根据权利要求54所述的经修饰的mrna，其中：

56.根据权利要求55所述的经修饰的mrna，其中m1的每个实例是1。

57.根据权利要求56所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例与所述第一5'帽的内部核苷酸共价连接。

58.根据权利要求56或57所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例在第二5'帽的3'核苷酸处与所述第二5'帽共价连接。

59.根据权利要求56至58中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例包括通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分。

60.根据权利要求59所述的经修饰的mrna，其中通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分具有下式：

61.根据权利要求56至60中任一项所述的经修饰的mrna，其中：

62.根据权利要求49至54中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

63.根据权利要求56至62中任一项所述的经修饰的mrna，其中：

64.根据权利要求56至62中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例具有下式：

65.根据权利要求56所述的经修饰的mrna，其中m1的每个实例独立地是介于2与20之间，包含端值，的整数。

66.根据权利要求65所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例包括树枝状大分子。

67.根据权利要求66所述的经修饰的mrna，其中所述树枝状大分子的至少一个实例是聚酰胺胺(pamam)树枝状大分子。

68.根据权利要求67所述的经修饰的mrna，其中所述pamam树枝状大分子的至少一个实例具有下式：

69.根据权利要求67或68所述的经修饰的mrna，其中所述pamam树枝状大分子的至少一个实例包括：

70.根据权利要求68所述的经修饰的mrna，其中所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

71.根据权利要求68所述的经修饰的mrna，其中所述第一接头的至少一个实例具有下式：

72.根据权利要求50至71中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例与所述第一5'帽的5'或3'核苷酸共价连接。

73.根据权利要求50至72中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第二接头的至少一个实例与所述第二5'帽的至少一个实例的5'或3'核苷酸共价连接。

74.根据权利要求50至73中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的mrna的所述5'帽区包括一个或多个经修饰的核苷酸。

75.根据权利要求74所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的核碱基。

76.根据权利要求75所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的核碱基选自由以下组成的组：黄嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黄嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鸟嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氢-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-甲酰基尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-鸟嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、阿糖腺嘌呤、阿糖胞嘧啶、阿糖鸟嘌呤、阿糖尿嘧啶、生物素-16-7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脱硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脱硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、异鸟嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鸟嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鸟嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黄苷、3-脱氮杂腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鸟嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-异戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-异戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(g6a)、n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(t6a)、2-甲基硫代-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(m6t6a)、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(hn6a)、2-甲基硫代-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙酰基腺嘌呤(ac6a)。

77.根据权利要求74至76中任一项所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的糖。

78.根据权利要求77所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的糖选自由以下组成的组：2'-硫代核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-氨基-2'-脱氧核糖、2'脱氧核糖、2'-叠氮基-2'-脱氧核糖、2'-氟-2'-脱氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脱氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脱氧核糖、3'-叠氮基-2',3'-二脱氧核糖、3'-脱氧核糖、3'-o-(2-硝基苄基)-2'-脱氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脱氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亚甲基连接的核糖、2'-o,4'-c-氨基连接的核糖和2'-o,4'-c-硫代连接的核糖。

79.根据权利要求74至78中任一项所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的磷酸酯。

80.根据权利要求79所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的磷酸酯选自由以下组成的组：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羟基膦酸酯、羟基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍环、三唑环、硼磷酸酯(bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

81.根据权利要求79或80所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个硫代磷酸酯。

82.根据权利要求81所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括5至30个硫代磷酸酯。

83.根据权利要求74至82中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个脱氧核糖。

84.根据权利要求83所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括5至30个脱氧核糖。

85.根据权利要求74至84中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、二脱氧鸟苷、二脱氧胸苷、二脱氧尿苷或反向脱氧胸苷。

86.根据权利要求50至85中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括25至500个核苷酸。

87.根据权利要求86所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500个核苷酸。

88.根据权利要求50至87中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括1至3、3至5、5至7或7至10个5'帽。

89.根据权利要求50至88中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括一个或多个包括5'-5'三磷酸酯键的7-甲基鸟苷酸帽。

90.根据权利要求50至89中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括一个或多个包括5'-5'三磷酸酯键的2,2,7-三甲基鸟苷帽。

91.根据权利要求50至90中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括一个或多个经修饰的5'帽。

92.根据权利要求91所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的5'帽是经锁定核酸(lna)修饰的帽、包括由5'-硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸酯键的5'帽或包括5'-5'四磷酸酯键的5'帽。

93.根据权利要求91或92所述的经修饰的mrna，其中所述5'帽区包括一个或多个包括一个或多个经修饰的核苷酸的5'帽。

94.根据权利要求93所述的经修饰的mrna，其中一个或多个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基化核苷酸。

95.根据权利要求50至94中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一5'帽包括10至50个核糖核苷酸、1至10个包括连接点的经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸和5'帽；并且所述第二5'帽包括10至50个核糖核苷酸和5'帽。

96.根据权利要求95所述的经修饰的mrna，其中：

97.根据权利要求95或96所述的经修饰的mrna，其中所述经修饰的尿苷脱氧核苷酸是5-辛二炔基脱氧尿苷。

98.根据权利要求50至94中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述第一5'帽包括5至10个核糖核苷酸和5'叠氮化物部分；并且所述第二5'帽包括10至50个核糖核苷酸、3'叠氮化物部分和5'帽。

99.根据权利要求98所述的经修饰的mrna，其中所述第一5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：

100.一种产生根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna的方法，所述方法包括在存在rna连接酶的情况下，将包括编码蛋白质的开放阅读框(orf)的第一rna与包括两个或更多个poly-a尾的加尾核酸和/或包括两个或更多个5'帽的加帽核酸连接，由此所述rna连接酶在所述第一rna的3'核苷酸与所述加尾核酸的5'核苷酸之间形成共价键，和/或在所述第一rna的5'核苷酸与所述加帽核酸的3'核苷酸之间形成共价键，以产生所述经修饰的mrna。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述经修饰的mrna包括5'非翻译区(5'utr)和3'非翻译区(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr与所述3'utr之间，其中所述3'utr位于所述orf与所连接的加尾核酸之间，并且其中所述5'utr位于所述orf与所连接的加帽核酸之间。

102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述加尾核酸包括第一poly-a尾和一个或多个第二poly-a尾，其中所述第一poly-a尾与所述3'utr共价连接。

103.一种经修饰的mrna，其通过根据权利要求98至100中任一项所述的方法产生。

104.一种递送剂，其包括根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna，其中所述递送剂包括脂质、肽、蛋白质、抗体、碳水化合物、纳米颗粒或微粒。

105.根据权利要求104所述的递送剂，其中所述纳米颗粒或所述微粒是脂质纳米颗粒或脂质微粒、聚合物纳米颗粒或聚合物微粒、蛋白质纳米颗粒或蛋白质微粒或固体纳米颗粒或固体微粒。

106.一种细胞，其包括根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna。

107.根据权利要求106所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

108.一种组合物，其包括根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂或根据权利要求106或107所述的细胞。

109.根据权利要求108所述的组合物，其中所述组合物进一步包括另外的药剂。

110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述另外的药剂是在施用于受试者时具有治疗效应的药剂。

111.根据权利要求109或110所述的组合物，其中所述另外的药剂是核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、小分子、适体、脂质或碳水化合物。

112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述另外的药剂是shrna、sirna或aso。

113.根据权利要求109至111中任一项所述的组合物，其中所述另外的药剂是抗原或佐剂。

114.根据权利要求108至113中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物，其中所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

115.一种方法，其包括将根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna或根据权利要求104或105所述的递送剂引入到细胞中。

116.一种方法，其包括将根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求106或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物引入到受试者体内。

117.一种预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求105或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码蛋白质。

118.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求106或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码蛋白质。

119.根据权利要求117或权利要求118所述的方法，其中所述蛋白质是来自引起所述疾病的细胞或病毒的蛋白质抗原或其片段。

120.根据权利要求117或权利要求118所述的方法，其中所述蛋白质是在所述受试者体内以比参考值的水平更低的水平表达的蛋白质。

121.一种替换受试者体内的酶的方法，所述方法包括将根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求106或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码酶。

122.根据权利要求116至117中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

123.根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求106或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物，其用于预防有需要的受试者的疾病。

124.根据权利要求1至99中任一项所述的经修饰的mrna、根据权利要求104或105所述的递送剂、根据权利要求106或107所述的细胞或根据权利要求108至114中任一项所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病。

125.一种试剂盒，其包括权利要求100至102中任一项的所述第一rna、所述加尾核酸和/或所述加帽核酸。

126.根据权利要求125所述的试剂盒，其进一步包括rna连接酶。

127.一种试剂盒，其包括根据权利要求114所述的药物组合物、用于将所述药物组合物施用于受试者的装置以及用于将所述药物组合物施用于受试者的说明书。