多尾和多帽mRNA及其用途的制作方法

背景技术：

1、信使rna(mrna)技术是常规小分子、dna和蛋白质治疗以及常规疫苗方法的新兴替代方案，因为它是有效的、可编程的，并且能够快速产生具有期望序列的mrna。mrna治疗是一个快速发展的领域，并且已经用于治疗性蛋白的表达，范围从血管再生因子(例如，血管内皮生长因子a(vegf-a)、gata结合蛋白4(gata4)、肌细胞增强因子2c(mef2c)、t盒转录因子5(tbx5)、心肌蛋白(myocd))到针对covid-19、流感和寨卡病毒(zika virus)的疫苗。尽管最近取得了临床成功，但mrna治疗仍然面临不稳定性、毒性、短期效力和潜在免疫应答的挑战。增加mrna的稳定性以增强其体内效力仍然是重要的问题，必须解决这个问题以增加mrna治疗在临床应用中的可行性。

技术实现思路

1、本文提供了具有经修饰的poly-a尾和/或经修饰的5'帽以改进mrna在细胞中和体外翻译系统中的稳定性，由此增强蛋白质的产生的经修饰的mrna，以及制备和使用此类经修饰的mrna的方法。常规mrna包括poly-a尾，所述poly-a尾在3'端处包含大约100-250个腺苷核苷酸。poly-a尾可以被去除3'核苷酸的细胞核酸外切酶降解或去除。一旦核酸外切酶去除poly-a尾并且开始去除3'非翻译区(utr)和/或开放阅读框(orf)的核苷酸，mrna就无法翻译成经编码的蛋白质。对3'核酸外切酶活性更具抗性的mrna降解更慢，并且因此更稳定，在细胞中的半衰期增加，并且因此可以从给定的mrna分子中产生更多的蛋白质。与poly-a结合蛋白(pabp)的结合也需要poly-a尾，pabp通过与真核起始因子4复合物(eif4g)结合来增强mrna分子的翻译。常规mrna还包含类似于poly-a尾的5'帽，其保护mrna免受5'核酸外切酶的影响，并且充当用于翻译机制募集的位点。含有一个或多个针对mrna的核碱基、糖或磷酸酯键的结构性修饰的经修饰的核苷酸可以干扰3'和5'核酸外切酶活性，从而使mrna更稳定。然而，抑制核酸外切酶的相同结构修饰也会阻碍酶将这些经修饰的核苷酸并入到mrna中的能力，从而使经修饰的mrna难以产生。

2、然而，已经证明了在不显著损害mrna的合成和/或翻译的情况下增强mrna分子的稳定性的替代性策略。本文公开了用于通过将多个poly-a尾连接到mrna的3'端上和/或将多个5'帽连接到5'端上来增强mrna稳定性的策略。一种策略涉及将包括一个或多个用点击化学柄修饰的核苷酸的寡核苷酸连接到现有mrna分子的3'和/或5'端上。包括3'poly-a尾或5'帽的另外的寡核苷酸进而通过点击化学反应与一个或多个经修饰的核苷酸连接(参见图1c和1g)。可替代地，通过点击化学反应将与树枝状大分子连接的寡核苷酸连接到现有mrna分子的3'和/或5'端上也可以获得相同的结果。同样用点击化学柄修饰的树枝状大分子进而通过点击化学反应与包括3'poly-a尾或5'帽的另外的寡核苷酸连接(参见图1e和1i)。除了通过保护现有mrna分子免受核酸外切酶活性的影响来延长mrna的寿命，由此减少orf的降解外，这些策略还可以直接增强mrna的翻译，因为与mrna连接的每个另外的poly-a尾或5'帽都可以与经修饰的mrna相互作用并募集其翻译机制。这些策略可以相互配合，并且也可以与其它已知的用于增强mrna稳定性的技术配合使用，所述技术包含例如，在mrna的3'和/或5'端处引入经修饰的核苷酸、将经修饰的核苷酸引入到mrna的3'和/或5'非翻译区(utr)中、将核酸外切酶抗性序列引入到mrna中和/或通过连接线性mrna的末端进行环化以产生环状mrna。

3、因此，在一些方面，本公开提供了一种经修饰的mrna，其包括：

4、(i)开放阅读框(orf)，所述orf编码蛋白质；

5、(ii)poly-a区；以及

6、(iii)5'帽区；

7、其中所述poly-a区位于所述orf的3'处并且包括10个或更多个核苷酸，并且所述5'帽区位于所述orf的5'处，并且其中所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，和/或所述5'帽区包括两个或更多个5'帽。

8、在一些实施例中，所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，所述5'帽区包括一个5'帽。在一些实施例中，所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括一个poly-a尾，所述5'帽区包括两个或更多个5'帽。在一些实施例中，所述经修饰的mrna包括poly-a区和5'帽区，所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，所述5'帽区包括两个或更多个5'帽。

9、在一些实施例中，所述经修饰的mrna包括5'非翻译区(5'utr)和3'非翻译区(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr与所述3'utr之间，其中所述3'utr位于所述orf与所述poly-a区之间，并且其中所述5'utr位于所述5'帽区与所述orf之间。

10、在一些实施例中，所述经修饰的mrna是线性mrna，其中所述5'帽区位于所述经修饰的mrna的5'端处，并且所述poly-a区位于所述经修饰的mrna的3'端处。

11、在一些实施例中，所述经修饰的mrna是环状mrna，其中所述poly-a区位于所述3'utr与所述5'帽区之间。

12、在一些实施例中，所述poly-a区包括两个或更多个poly-a尾，并且所述poly-a尾的至少两个实例通过第一接头共价连接。

13、在一些实施例中，所述poly-a区包括-(第一poly-a尾)-[(第一接头)–(第二poly-a尾)n1]n2；其中n1的每个实例独立地是介于1与20之间(包含端值)的整数，n2是介于2与10之间(包含端值)的整数，所述第一poly-a尾与所述3'utr共价连接，并且所述第一接头与所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾共价连接。

14、在一些实施例中，n1的每个实例是1。

15、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例与所述第一poly-a尾的内部核苷酸共价连接。

16、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例在第二poly-a尾的3'核苷酸处与所述第二poly-a尾共价连接。

17、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例包括通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分。

18、在一些实施例中，通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分具有下式：

19、

20、在一些实施例中，所述第一接头的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基、经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基；并且任选地所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基替换。

21、在一些实施例中，所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

22、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例具有下式：l1的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-199亚烷基或经取代的或未经取代的c1-199亚杂烷基；并且l2的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-199亚烷基或经取代的或未经取代的c1-199亚杂烷基。

23、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例具有下式：

24、

25、在一些实施例中，n1的每个实例独立地是介于2与20之间(包含端值)的整数。

26、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例包括树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第一代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第二代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第三代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第四代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例包括2、3、4、5、6、7或8个树突。

27、在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是聚丙烯亚胺树枝状大分子、聚丙烯胺树枝状大分子、聚(谷氨酸)树枝状大分子、聚三聚氰胺树枝状大分子、聚酯树枝状大分子或聚乙二醇化树枝状大分子。在一些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是聚酰胺胺(pamam)树枝状大分子。

28、在一些实施例中，所述pamam树枝状大分子的至少一个实例具有下式：

29、

30、其中n3的每个实例独立地是介于1与10之间(包含端值)的整数；n4的每个实例独立地是介于0与10之间(包含端值)的整数；r2的每个实例独立地是氢或条件是r2的至少三个实例是r1的每个实例是经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基或经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基；任选地所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基替换；并且n5的每个实例独立地是介于0与10之间(包含端值)的整数。

31、在一些实施例中，所述pamam树枝状大分子的至少一个实例包括：

32、

33、在一些实施例中，所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

34、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例具有下式：

35、

36、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例与所述第一poly-a尾的所述3'核苷酸共价连接。

37、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例与所述第二poly-a尾的所述3'核苷酸共价连接。

38、在一些实施例中，所述经修饰的mrna的所述poly-a区包括一个或多个经修饰的核苷酸。

39、在一些实施例中，所述两个或更多个poly-a尾中的至少一个poly-a尾的最后10个核苷酸中的3个或更多个核苷酸是经修饰的核苷酸和/或非腺苷核苷酸。

40、在一些实施例中，所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸是经修饰的腺苷核苷酸。

41、在一些实施例中，所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸是经修饰的非腺苷核苷酸。

42、在一些实施例中，所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的核碱基。

43、在一些实施例中，由所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括的所述经修饰的核碱基选自由以下组成的组：黄嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黄嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鸟嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氢-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-甲酰基尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-鸟嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、阿糖腺嘌呤、阿糖胞嘧啶、阿糖鸟嘌呤、阿糖尿嘧啶、生物素-16-7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脱硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脱硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、异鸟嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鸟嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鸟嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黄苷、3-脱氮杂腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鸟嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-异戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-异戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(g6a)、n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(t6a)、2-甲基硫代-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(m6t6a)、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(hn6a)、2-甲基硫代-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙酰基腺嘌呤(ac6a)。

44、在一些实施例中，所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的糖。

45、在一些实施例中，由所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括的所述经修饰的糖选自由以下组成的组：2'-硫代核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-氨基-2'-脱氧核糖、2'脱氧核糖、2'-叠氮基-2'-脱氧核糖、2'-氟-2'-脱氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脱氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脱氧核糖、3'-叠氮基-2',3'-二脱氧核糖、3'-脱氧核糖、3'-o-(2-硝基苄基)-2'-脱氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脱氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亚甲基连接的核糖、2'-o,4'-c-氨基连接的核糖和2'-o,4'-c-硫代连接的核糖。

46、在一些实施例中，所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的磷酸酯。

47、在一些实施例中，由所述poly-a区的一个或多个经修饰的核苷酸包括的所述经修饰的磷酸酯选自由以下组成的组：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羟基膦酸酯、羟基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍环、三唑环、硼磷酸酯(bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

48、在一些实施例中，所述poly-a区包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个硫代磷酸酯。

49、在一些实施例中，其中所述poly-a区包括5至30个硫代磷酸酯。

50、在一些实施例中，所述poly-a区包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个脱氧核糖。

51、在一些实施例中，所述poly-a区包括5至30个脱氧核糖。

52、在一些实施例中，所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、二脱氧鸟苷、二脱氧胸苷、二脱氧尿苷或反向脱氧胸苷。

53、在一些实施例中，所述poly-a区包括25至500个核苷酸。

54、在一些实施例中，所述poly-a区包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500个核苷酸。

55、在一些实施例中，所述poly-a区包括10个或更多个腺苷核苷酸。

56、在一些实施例中，所述poly-a区的核苷酸的25-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％、96-100％、97-100％、98-100％或99-100％是腺苷核苷酸。

57、在一些实施例中，所述第一poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸、1至10个包括连接点的经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸和3'末端双脱氧核糖核苷酸或反向脱氧核糖核苷酸；并且所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸。

58、在一些实施例中，所述第一poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararadu(a1)rarararararararararararadu(a1)rarararararararararararad u(a1)ddc-3'(seq id no:1)；其中所述第二poly-a尾的至少一个实例包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararararararararararararararararararararara*ra*ra*ra*ra*ra*(b1)-3'(seq id no:2)；并且所述第一接头的每个实例独立地是其中“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“du(a1)”表示经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸；“ddc”表示胞嘧啶双脱氧核糖核苷酸；“*”表示硫代磷酸酯键；du(a1)的每个实例的a1表示所述du(a1)的尿苷上的连接点；ra*(b1)的b1表示所述ra*(b1)的*上的连接点；a1的每个实例与a2的实例连接；并且b1的每个实例与b2的实例连接。在一些实施例中，经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸是5-辛二炔基脱氧尿苷。

59、在一些实施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸和3'末端叠氮化物部分。

60、在一些实施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50个腺苷核糖核苷酸和5'末端叠氮化物部分。

61、在一些实施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararararararararararararararararararararara*ra*ra*ra*ra*ra*/叠氮化物n/-3'(seq id no:3)；其中“叠氮化物n”表示3'叠氮化物部分，并且“*”表示硫代磷酸酯键。

62、在一些实施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-5/叠氮化物n/rarararararararararararararararararararararararar a*ra*ra*ra*ra*ra-3'(seq id no:27)；其中“叠氮化物n”表示3'叠氮化物部分，并且“*”表示硫代磷酸酯键。

63、在一些实施例中，所述5'帽区包括两个或更多个5'帽，并且所述5'帽的至少两个实例通过第二接头共价连接。

64、在一些实施例中，所述5'帽区包括-(第一5'帽)-[(第二接头)-(第二5'帽)m1]m2；其中m1的每个实例独立地是介于1与20之间(包含端值)的整数；m2是介于2与10之间(包含端值)的整数；所述第一5'帽与所述5'utr共价连接；并且所述第二接头与所述第一5'帽和所述第二5'帽共价连接。

65、在一些实施例中，m1的每个实例是1。

66、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例与所述第一5'帽的内部核苷酸共价连接。

67、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例在第二5'帽的所述3'核苷酸处与所述第二5'帽共价连接。

68、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例包括通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分。

69、在一些实施例中，通过使两个正交点击化学柄反应而形成的至少一个部分具有下式：

70、

71、在一些实施例中，所述第二接头的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基、经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基；并且任选地所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基替换。

72、在一些实施例中，所述经取代的或未经取代的c1-200亚烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚烯基、经取代的或未经取代的c1-200亚炔基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-200亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-200亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

73、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例具有下式：l3的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-199亚烷基或经取代的或未经取代的c1-199亚杂烷基；并且l4的每个实例独立地是经取代的或未经取代的c1-199亚烷基或经取代的或未经取代的c1-199亚杂烷基。

74、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例具有下式：

75、

76、在一些实施例中，m1的每个实例独立地是介于2与20之间(包含端值)的整数。

77、在一些实施例中，第二接头的至少一个实例包括树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第一代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第二代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第三代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是第四代树枝状大分子。在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例包括2、3、4、5、6、7或8个树突。

78、在某些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是聚丙烯亚胺树枝状大分子、聚丙烯胺树枝状大分子、聚(谷氨酸)树枝状大分子、聚三聚氰胺树枝状大分子、聚酯树枝状大分子或聚乙二醇化树枝状大分子。在一些实施例中，所述树枝状大分子的至少一个实例是聚酰胺胺(pamam)树枝状大分子。

79、在一些实施例中，所述pamam树枝状大分子的至少一个实例具有下式：

80、

81、其中m3的每个实例独立地是介于1与10之间(包含端值)的整数；m4的每个实例独立地是介于0与10之间(包含端值)的整数；r12的每个实例独立地是氢或条件是r12的至少三个实例是r11的每个实例是经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基或经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基；任选地所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被经取代的或未经取代的亚碳环基、经取代的或未经取代的亚杂环基、经取代的或未经取代的亚芳基或经取代的或未经取代的亚杂芳基替换；并且m5的每个实例独立地是介于0与10之间(包含端值)的整数。

82、在一些实施例中，所述pamam树枝状大分子的至少一个实例包括：

83、

84、在一些实施例中，所述经取代的或未经取代的c1-10亚烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚烯基、经取代的或未经取代的c1-10亚炔基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烷基、经取代的或未经取代的c1-10亚杂烯基和经取代的或未经取代的c1-10亚杂炔基的每个实例的母链中的一个或多个碳原子独立地被替换。

85、在一些实施例中，所述第一接头的至少一个实例具有下式：

86、

87、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例与所述第一5'帽的3'核苷酸共价连接。

88、在一些实施例中，所述第二接头的至少一个实例与所述第二5'帽的至少一个实例的3'核苷酸共价连接。

89、在一些实施例中，所述经修饰的mrna的所述5'帽区包括一个或多个经修饰的核苷酸。

90、在一些实施例中，所述5'帽区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的核碱基。

91、在一些实施例中，所述经修饰的核碱基选自由以下组成的组：黄嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黄嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鸟嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氢-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-甲酰基尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-鸟嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-叠氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、阿糖腺嘌呤、阿糖胞嘧啶、阿糖鸟嘌呤、阿糖尿嘧啶、生物素-16-7-脱氮杂-7-炔丙基氨基鸟嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脱硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脱硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、异鸟嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鸟嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鸟嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黄苷、3-脱氮杂腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鸟嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-异戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-异戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(g6a)、n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(t6a)、2-甲基硫代-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(m6t6a)、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(hn6a)、2-甲基硫代-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺嘌呤(ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙酰基腺嘌呤(ac6a)。

92、在一些实施例中，所述5'帽区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的糖。

93、在一些实施例中，由所述5'帽区的一个或多个经修饰的核苷酸包括的所述经修饰的糖选自由以下组成的组：2'-硫代核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-氨基-2'-脱氧核糖、2'脱氧核糖、2'-叠氮基-2'-脱氧核糖、2'-氟-2'-脱氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脱氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脱氧核糖、3'-叠氮基-2',3'-二脱氧核糖、3'-脱氧核糖、3'-o-(2-硝基苄基)-2'-脱氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脱氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亚甲基连接的核糖、2'-o,4'-c-氨基连接的核糖和2'-o,4'-c-硫代连接的核糖。

94、在一些实施例中，所述5'帽区的一个或多个经修饰的核苷酸包括经修饰的磷酸酯。

95、在一些实施例中，由所述5'帽区的一个或多个经修饰的核苷酸包括的所述经修饰的磷酸酯选自由以下组成的组：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羟基膦酸酯、羟基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍环、三唑环、硼磷酸酯(bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

96、在一些实施例中，所述5'帽区包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个硫代磷酸酯。

97、在一些实施例中，所述5'帽区包括5至30个硫代磷酸酯。

98、在一些实施例中，所述5'帽区包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200个脱氧核糖。

99、在一些实施例中，所述5'帽区包括5至30个脱氧核糖。

100、在一些实施例中，所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、二脱氧鸟苷、二脱氧胸苷、二脱氧尿苷或反向脱氧胸苷。

101、在一些实施例中，所述5'帽区包括25-500个核苷酸。

102、在一些实施例中，所述5'帽区包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500个核苷酸。

103、在一些实施例中，所述5'帽区包括1至3、3至5、5至7或7至10个5'帽。

104、在一些实施例中，所述5'帽区包括一个或多个包括5'-5'三磷酸酯键的7-甲基鸟苷酸帽。

105、在一些实施例中，所述5'帽区包括一个或多个包括5'-5'三磷酸酯键的2,2,7-三甲基鸟苷帽。

106、在一些实施例中，所述5'帽区包括一个或多个经修饰的5'帽。

107、在一些实施例中，一个或多个经修饰的5'帽是经锁定核酸(lna)修饰的帽、包括由5'-硫代磷酸酯修饰的5'-5'三磷酸酯键的5'帽或包括5'-5'四磷酸酯键的5'帽。

108、在一些实施例中，所述5'帽区包括一个或多个包括一个或多个经修饰的核苷酸的5'帽。

109、在一些实施例中，由所述5'帽包括的一个或多个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基化核苷酸。

110、在一些实施例中，所述第一5'帽包括10至50个核糖核苷酸、1至10个包括连接点的经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸和5'帽；并且所述第二5'帽包括10至50个核糖核苷酸和5'帽。

111、在一些实施例中，所述第一5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrararadu(c1)rarargrargrargrarararargrarargrargdu(c1)rarargrarargrararadu(c1)ra-3'(seq id no:4)；所述第二5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrargrarcrtrgrcrcrarcrcra*ra*ra*ra*ra*ra*(d1)-3'(seq id no:5)；并且所述第二接头的每个实例独立地是

112、“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“rt”表示胸苷核糖核苷酸；“rc”表示胞苷核糖核苷酸；“rg”表示鸟苷核糖核苷酸；“du(c1)”表示经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸；“du(c1)”表示经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸；其中“*”表示硫代磷酸酯键；“cap”表示5'帽；du(c1)的每个实例的c1表示所述du(c1)的尿苷上的连接点；ra*(d1)的d1表示所述ra*(d1)的*上的连接点；c1的每个实例与c2的实例连接；并且d1的每个实例与d2的实例连接。在一些实施例中，所述经修饰的尿苷脱氧核苷酸是5-辛二炔基脱氧尿苷。

113、在一些实施例中，所述第一5'帽包括5至10个核糖核苷酸和5'叠氮化物部分；并且所述第二5'帽包括10至50个核糖核苷酸、3'叠氮化物部分和5'帽。

114、在一些实施例中，所述第一5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/5叠氮化物n/rarara rara-3'；并且所述第二5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrargrarcrtrgrcrcrarcrcra*ra*ra*ra*ra*ra*/3叠氮化物n/-3'(seq id no:6)；其中“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“rt”表示胸苷核糖核苷酸；“rc”表示胞苷核糖核苷酸；“rg”表示鸟苷核糖核苷酸；“du(c1)”表示经修饰的尿苷脱氧核糖核苷酸；“5叠氮化物n”表示5'叠氮化物部分；“3叠氮化物n”表示3'叠氮化物部分，“*”表示硫代磷酸酯键，并且“cap”表示5'帽。

115、在一些方面，本公开提供了一种产生本文所描述的经修饰的mrna中的任一种的方法，所述方法包括在存在rna连接酶的情况下，将包括编码蛋白质的开放阅读框(orf)的第一rna与包括两个或更多个poly-a尾的加尾核酸和/或包括两个或更多个5'帽的加帽核酸连接，由此所述rna连接酶在所述第一rna的3'核苷酸与所述加尾核酸的5'核苷酸之间形成共价键，和/或在所述第一rna的5'核苷酸与所述加帽核酸的3'核苷酸之间形成共价键，以产生所述经修饰的mrna。

116、在一些实施例中，所述经修饰的mrna包括5'非翻译区(5'utr)和3'非翻译区(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr与所述3'utr之间，其中所述3'utr位于所述orf与所连接的加尾核酸之间，并且其中所述5'utr位于所述orf与所连接的加帽核酸之间。

117、在一些实施例中，所述加尾核酸包括第一poly-a尾和一个或多个第二poly-a尾，其中所述第一poly-a尾与所述3'utr共价连接。

118、在一些方面，本公开提供了一种通过本文所提供的产生经修饰的mrna的方法产生的经修饰的mrna。

119、在一些方面，本公开提供了一种递送剂，其包括本文所提供的经修饰的mrna中的任一种，其中所述递送剂包括脂质、肽、蛋白质、抗体、碳水化合物、纳米颗粒或微粒。

120、在一些实施例中，本文所提供的纳米颗粒或微粒是脂质纳米颗粒或脂质微粒、聚合物纳米颗粒或聚合物微粒、蛋白质纳米颗粒或蛋白质微粒或固体纳米颗粒或固体微粒。

121、在一些方面，本公开提供了包括本文所提供的经修饰的mrna中的任一种的细胞。

122、在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。

123、在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包括本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂或本文所提供的细胞中的任一者。

124、在一些实施例中，所述组合物进一步包括另外的药剂。在一些实施例中，所述另外的药剂是在向受试者施用时具有治疗作用的药剂。在一些实施例中，所述另外的药剂是核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、小分子、适体、脂质或碳水化合物。在一些实施例中，所述另外的药剂是shrna、sirna或aso。在一些实施例中，所述另外的药剂是抗原或佐剂。

125、在一些实施例中，所述组合物是药物组合物，其中所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

126、在一些方面，本公开提供了一种方法，其包括将本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂或本文所提供的组合物中的任一者引入到细胞中。

127、在一些方面，本公开提供了一种方法，其包括将本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂、本文所提供的细胞或本文所提供的组合物中的任一者引入到受试者中。

128、在一些方面，本公开提供了一种预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂、本文所提供的细胞或本文所提供的组合物中的任一者引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码蛋白质。

129、在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂、本文所提供的细胞或本文所提供的组合物中的任一者引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码蛋白质。

130、在一些实施例中，所述蛋白质是来自引起所述疾病的细胞或病毒的蛋白质抗原或其片段。

131、在一些实施例中，所述蛋白质是在所述受试者体内以比参考值的水平更低的水平表达的蛋白质。

132、在一些方面，本公开提供了一种替换受试者体内的酶的方法，所述方法包括将本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂、本文所提供的细胞或本文所提供的组合物中的任一者引入到所述受试者体内，其中所述经修饰的mrna的所述开放阅读框编码酶。

133、在一些实施例中，所述受试者是人。

134、在一些方面，本公开提供了本文所提供的经修饰的mrna、本文所提供的递送剂、本文所提供的细胞或本文所提供的组合物中的任一者，其用于治疗有需要的受试者的疾病。

135、在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括所述第一rna以及产生本文所提供的经修饰的mrna中的任一种的方法中的所述加尾核酸和/或所述加帽核酸。

136、在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括rna连接酶。

137、在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括本文所提供的药物组合物、用于将所述药物组合物施用于受试者的装置以及用于将所述药物组合物施用于受试者的说明书。