一种高产林可霉素菌株的高通量筛选方法

本发明涉及微生物育种和生物发酵领域，具体涉及一种高产林可霉素菌株的高通量筛选方法。

背景技术：

1、林可链霉菌(streptomyces lincolnensis)属于链霉菌属，其孢子呈现椭圆形、短杆状，表面光滑，产生的次级代谢产物是林可霉素(lincomycin)。林可霉素的分子结构是c18h34n2o6s，分子量为406.56。林可霉素的化学结构主要由两部分缩合修饰而成，一部分是以l-酪氨酸(l-tyr)为前体物质而生成的反式-n-甲基-4-正丙基脯氨酸(propylproline,ppl)，另一部分是由7-磷酸景天庚酮糖(sedoheptulose-7-phosphate,s7p)和5-磷酸戊糖(ribose-5-phosphate，r5p)为前体合成的甲基硫林可酰胺(methylthiolincosamide,mtl)。林可霉素对表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)和溶血性链球菌(streptococcus hemolyticus)等革兰氏阳性菌具有非常强的抗菌效果，并且与青霉素、氯霉素、头孢菌素类和四环素类之间无交叉耐药，在医疗应用上具有广泛的选择性。此外林可霉素价格低廉，对某些呼吸道感染等疾病具有显著疗效，目前在市场依然占有较高份额。但国内在林可霉素a产量方面与国外存在很大差距，林可链霉菌的菌株性能直接影响到林可霉素产量的高低，因此，筛选林高产林可霉素菌株对林可霉素的推广应用至关重要。

2、目前报道的筛选林可链霉菌的方法主要包括紫外诱变筛选、化学诱变、平板分离等方法，然而无论诱变得到的突变菌株还是多重基因工程改造构建的突变菌株的筛选，均存在菌株数量大、筛选周期长、筛选方法操作繁琐等问题。而林可霉素的检测方法也主要集中在hplc检测，检测周期长，单次检测仅限一个样品，当样品数量较大时，不适于发酵过程的随时取样检测。因此，需要开发高产林可霉素的高通量筛选方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种高产林可霉素的高通量筛选方法。

2、本发明提供一种高产林可霉素菌株的高通量筛选方法，包括以下步骤；

3、(1)将林可链霉菌进行发酵培养；

4、(2)提取发酵液中的林可霉素，得到检测样品；

5、(3)在检测样品中加入磷酸缓冲液、草酸；

6、(4)测定214nm处的吸光度值，根据吸光度值计算林可霉素产量；

7、具体地，本发明所述的包含以下组分：

8、磷酸缓冲液：0.01-0.05mol/l；草酸：6-10g/l。

9、本发明中，所述的提取发酵液中的林可霉素为在发酵液中加入磷酸缓冲液进行提取。

10、优选地，所述发酵液和磷酸缓冲液的体积比为1:1-1:1.5。

11、本发明所述检测样品的制备为取林可霉素发酵液进行10000-12000rpm，离心5-10min，分离上清液和沉淀，得到的上清液即为检测样品。

12、本发明所述的高通量筛选方法，所述发酵培养基由以下组分构成：

13、葡萄糖100-120g/l，黄豆粉25-30g/l，玉米浆2-5g/l，氯化钠5-10g/l，磷酸二氢钾0.2-0.5g，硫酸铵8-10g，硝酸钠8-10g/l，碳酸钙8-10g/l。

14、所述发酵培养基的ph为6.9-7.0。

15、优选地，所述发酵培养为在多孔板中培养。

16、更优选地，所述多孔板为24深孔培养板。

17、所述发酵的温度为30-32℃，转速为220-250rpm。

18、作为本发明的优选实施方式，所述发酵温度为30℃，所述转速为220-230rpm。

19、本发明所述的发酵培养的种子为采用多孔板培养，种子培养的温度为30-32℃，转速为220-250rpm。

20、本发明所述的种子培养基包括如下组分：葡萄糖10-15g/l，黄豆粉20-25g/l，玉米淀粉30-35g/l，硫酸铵2-5g/l，碳酸钙5-10g/l。

21、所述种子培养基的ph为6.9-7.0。

22、所述发酵培养的接种量为5-20％。

23、优选地，所述发酵培养的接种量为5-10％。

24、所述林可霉素生产菌株为链霉菌属微生物，即为林可链霉菌。

25、所述林可霉素生产菌株可以为诱变育种、基因工程育种或其结合的方法选育得到的能够积累林可霉素的菌株。

26、本发明提供了高产林可霉素菌株的高通量筛选方法，快速准确的产物检测法是对菌株进行高通量筛选的前提和基础，针对林可霉素的相关性质，发明人发现林可霉素于磷酸缓冲液在214nm处产生吸收峰，且吸光度值与发酵液中的林可霉素含量具有很好的线性相关性，与hplc检测的林可霉素产量也有很好的正相关性。结合多孔板的培养方法以及发酵液中林可霉素的提取方法，最终得到了高效的高产林可霉素菌株的高通量筛选方法。

27、本发明的有益效果在于：

28、(1)本发明建立高产林可霉素菌株的高通量筛选方法，结合多孔板培养和快速简单的检测方法，能够通过一次操作对大量菌株进行林可霉素生产性能的筛选，快速淘汰负突变菌株，筛选高产菌株。

29、(2)本发明的高通量筛选方法，与传统的筛选方法相比，具有快速高效、简单易行等优势，能够大大缩短筛选周期，提高菌株的筛选效率，极大地降低选育高产林可霉素菌株的工作量，为高产菌株的选育提供了有力的技术保障。

1.一种高产林可霉素菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，检测样品和磷酸缓冲液的体积比在1:1-1:1.5。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述检测样品的制备为取林可霉素发酵液进行10000-12000rpm，离心5-10min，分离上清液和沉淀，得到的上清液即为检测样品。

4.根据权利要求1、2和3所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵培养基由以下组分构成：葡萄糖100-120g/l，黄豆粉25-30g/l，玉米浆2-5g/l，氯化钠5-10g/l，磷酸二氢钾0.2-0.5g，硫酸铵8-10g，硝酸钠8-10g/l，碳酸钙8-10g/l。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵培养为在24深孔板培养。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵的温度在30℃，转速为200-220rpm。

7.根据权利要求1、2、3、5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述林可霉素菌株为链霉菌属微生物。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述链霉菌属微生物为林可链霉菌(streptomyces lincolnensis)。