一种细胞外囊泡长链RNA文库构建方法

本发明属于生物，更具体地，本发明涉及一种细胞外囊泡长链rna文库制备方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)是细胞释放到胞外间隙的膜结构，它大小不一(从40纳米到几微米)，由磷脂双分子层膜包裹。最近的研究表明，ev可以作为转移生物活性分子的载体，运输蛋白质、脂质、dna和rna，完成细胞与细胞之间的信息交流。同时它还参与到多种生理和病理的过程中，比如炎症反应、免疫失调、神经性疾病和癌症。因此，这一研究领域得到人们越来越多的关注。

2、肿瘤细胞释放的细胞外囊泡中含有肿瘤所特有的一些内容物，如特异表达的表面蛋白、肿瘤特有的突变的dna片段和特有高表达的rna片段等。越来越多的研究认为肿瘤来源的细胞外囊泡能够随着血液循环并影响其受体细胞的功能和代谢，创建新的适合肿瘤细胞生长的微环境，从而促进肿瘤细胞的转移。因此血液中的细胞外囊泡可以作为一种新型的肿瘤鉴定的分子标志物使用，其数量、大小和种类等信息和其中含有的蛋白质、脂质、dna和rna等生物大分子皆可以用于相关肿瘤的鉴定。其中大量存在的rna分子，信息丰富且能真实体现肿瘤细胞的生理状态，是一种优秀的肿瘤鉴定标志物。

3、细胞外囊泡中rna与细胞内rna的组成和大小都有较大差异。细胞内rna大小分布在400-12,000nt之间，而细胞外囊泡中rna在500nt以下，主要是一些长rna碎片和不同类型的小rna，包括mrna碎片、lncrna碎片、mirna、pirna、rrna碎片、trna碎片和y-rna碎片等，这导致了其长链文库的制备存在技术瓶颈。

4、高通量测序手段是一种高效的研究rna分子组成和丰度的方法，能够用于快速的筛选肿瘤鉴定的rna标志物。得益于小rna测序技术的成熟，细胞外囊泡中小rna种类和表达已经被人们所熟知，且广泛用于肿瘤等疾病的早期筛查、预后和复发检测。相比于小rna，研究者们对细胞外囊泡中长链rna的了解不多，其中一个关键因素在于细胞外囊泡中长链rna分子的特殊性，导致当前常用的rnas-seq方法都不适用：细胞外囊泡长链rna一般是碎片化的rna，比较短且不具有poly(a)尾巴，因此无法使用基于oligo-dt反转录的方式进行文库的制备；细胞外囊泡rna的产量比较低，平均1ml血浆只能够获得大约2-5ng细胞外囊泡rna，因此大多数基于随机引物反转录的方法因灵敏度不足而无法使用。

5、因此，当前针对细胞外囊泡长链rna文库制备方法缺乏，极大地限制了对细胞外囊泡长链rna种类和丰度的研究，也极大地阻碍了使用细胞外囊泡长链rna信息作为疾病诊疗标志物的发展。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞外囊泡长链rna文库的制备方法，该方法以细胞外囊泡rna为模板，使用随机引物反转录，通过“预扩增-纯化-再扩增”的方法，结合cas9-sgrna处理，获得细胞外囊泡长链rna文库。本发明也提供了制备获得的细胞外囊泡长链rna文库及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种细胞外囊泡(ev)长链rna文库的制备方法，其包括：

3、i)提供细胞外囊泡rna，进行rna片段化，获得片段化产物；

4、ii)使用随机引物反转录，获得反转录产物；

5、iii)对反转录产物进行第一次扩增(预扩增)，纯化获得cdna；

6、iv)通过crispr/cas方法，以靶向核糖体rna(rrna)的sgrna去除核糖体rna；

7、v)进行第二次扩增，纯化cdna，从而获得细胞外囊泡长链rna文库。

8、在一种或多种实施方式中，所述的长链为链长80-6000nt、优选地100-1000nt的核酸链。

9、在一种或多种实施方式中，所述cas为cas9。

10、在一种或多种实施方式中，所述细胞外囊泡rna为从细胞外囊泡中提取的rna；较佳地，所述细胞外囊泡来源于细胞、组织及体液；更佳地，所述细胞外囊泡来源于细胞上清液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、鼻分泌液、肺泡冲洗液、乳汁、滑液、精液、宫腔液、胆汁、淋巴液、粪便、脂肪组织、脑组织、羊水、胚胎培养液。

11、在一种或多种实施方式中，所述步骤i)还包括：去除细胞外囊泡rna中的dna。

12、在一种或多种实施方式中，所述去除细胞外囊泡rna中的dna包括：dna酶处理法去除细胞外囊泡rna中的dna。

13、在一种或多种实施方式中，所述dna酶包括：dnase i、turbo dnase。

14、在一种或多种实施方式中，对应1ng细胞外囊泡rna，使用0.25-0.50个单位dna酶。

15、在一种或多种实施方式中，对应1ng细胞外囊泡rna，使用0.28-0.45个单位dna酶，如使用0.30、0.32、0.33、0.35、0.38、0.40、0.42个单位dna酶。

16、在一种或多种实施方式中，所述dna酶处理的温度为37±5℃；较佳地37±3℃或37±2℃或37±1℃。

17、在一种或多种实施方式中，所述dna酶处理的时间为30±15分钟；较佳地为30±10分钟；更佳地为30±5分钟。

18、在一种或多种实施方式中，所述步骤i)中，所述rna片段化包括：通过化学法和/或酶消化法进行rna打断处理；较佳地，rna片段化后，rna片段大小为80～300nt；更佳地，rna在含镁离子的反转录缓冲液中片段化。

19、在一种或多种实施方式中，所述片段化在高温下进行。

20、在一种或多种实施方式中，所述片段化的温度为84±20℃；较佳地为84±15℃、84±10℃或84±5℃。

21、在一种或多种实施方式中，所述片段化的时间为2±1分钟；较佳地为2±0.5分钟；更佳地为2±0.3分钟。

22、在一种或多种实施方式中，所述镁离子的浓度为1-5mm。

23、在一种或多种实施方式中，所述反转录缓冲液为tris-hcl,ph 8.3 25℃。

24、在一种或多种实施方式中，所述步骤ii)包括：使用随机引物反转录并添加3’接头序列，以及模板转换并添加5’接头序列。

25、在一种或多种实施方式中，所述随机引物携带兼容illumina测序接头序列，更佳地，所述illumina测序接头序列如seq id no:1或2所示。

26、在一种或多种实施方式中，所述模板转换是通过模板转换寡核苷酸，使得cdna的末端添加上5’端的接头序列；更佳地，所述模板转换寡核苷酸序列如seq id no:3或29所示。

27、在一种或多种实施方式中，所述步骤iv)中，所述sgrna包括选自如seq id no：30～108所示核苷酸序列的sgrna(如含有至少20、30、40、50、60、70、80条)。

28、在一种或多种实施方式中，所述步骤iii)和所述步骤v)中所述的纯化方法为利用磁珠进行纯化；较佳地，利用磁珠纯化后获得的cdna片段大小为200-500bp。

29、在一种或多种实施方式中，所述步骤iii)和所述步骤v)中所述的扩增为pcr扩增；较佳地，所述步骤iii)中pcr扩增为低循环数(5～7个循环)的pcr扩增，所述步骤v)中pcr扩增为高循环数(7～10个循环)的pcr扩增。

30、在一种或多种实施方式中，步骤iii)中，进行第一次扩增时，以seq id no:5和6、或seq id no:7和8所示的引物进行扩增，和/或，步骤v)中，进行第二次扩增时，以seq idno:7和8、或seq id no:27和28所示的引物进行扩增。

31、在一种或多种实施方式中，所述制备方法还包括：对获得的细胞外囊泡长链rna文库进行质检，和/或测序。

32、在一种或多种实施方式中，所述质检包括：cdna文库浓度的测定、文库大小分布的检测和/或荧光定量pcr分析。

33、在本发明的第二方面，提供一种细胞外囊泡长链rna文库，其通过本发明所述的细胞外囊泡长链rna文库的制备方法制备获得。

34、在本发明的第三方面，提供本发明所述的细胞外囊泡长链rna文库的制备方法的应用，包括(但不限于)用于：

35、进行测序分析或序列比较；

36、进行基因的结构、表达或调控的分析；

37、筛选或分析功能基因；

38、筛选或分析疾病基因(致病基因)；

39、监控或分析试管胚胎质量或精子质量；或

40、分析基因丰度。

41、在一种或多种实施方式中，所述疾病包括(但不限于)：肿瘤、先兆子痫、帕金森。

42、在一种或多种实施方式中，所述筛选或分析包括在没有患病，疾病早期、中期、晚期或预后进行筛选或分析。

43、在本发明的第四方面，提供一种从细胞外囊泡rna的cdna产物(较佳地为预扩增产物)中去除核糖体rna的方法，其包括：利用靶向核糖体rna的sgrna、通过crispr/cas方法去除核糖体rna；较佳地，所述sgrna包括选自如seq id no：30～108所示核苷酸序列的sgrna(如含有至少20、30、40、50、60、70、80条)。

44、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。