强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组及其制备方法与应用

本发明涉及农业病害防治的，特别是涉及一种强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组及其制备方法与应用。

背景技术：

1、黄瓜枯萎病(cucumber fusarium wilt)被称为植物中的“癌症”，是黄瓜生产过程中一种破坏力极强的土传病害，对黄瓜的产量和品质危害极大。黄瓜枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporum f.sp.cucumerium,foc)，属于半知菌亚门(deuteromycotina)丝孢纲(hyphomycetes)从梗孢目(moniliales)瘤座孢科(tuberculariaceae)镰刀菌属(fusarium)。尖孢镰刀菌黄瓜专化型目前已鉴定出4个生理小种，我国的病原菌属于4号生理小种。该病原菌在25-30℃时，从黄瓜根茎部的伤口或根毛生长点侵入并于维管束内寄生繁殖，堵塞导管，阻碍植株对营养和水分的吸收，并能够产生毒素破坏植物的防御系统，致使植物死亡。由于黄瓜枯萎病具有爆发性强、破坏力大、防控难等特征，目前，对其的防治主要以预防为主，具体方法包括：抗病品种选育、农业防治、化学农药防治以及生物防治。

2、生物防治因为具有环保、可持续等特点，已成为防治作物土传病害的研究热点，随着微生物组学的快速进展，生物防治中的核心微生物组的构建策略越来越引人关注。根际土壤微生物组是抵御病原菌入侵植物根系的第一道防线。接种有益微生物组(群)可以在作物根际周围形成生物屏障、抑制有害微生物、诱导作物产生免疫机能，从而对植物提供一致和持久的保护。但当前研究主要集中在单一有益菌株的使用，忽视了微生物组对植株根际的直接或协同作用，造成单一有益菌常因根际定殖能力不强而无法实现田间稳定抑病。

3、因此，为了解决以上问题，本技术中提供一种强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组及其制备方法与应用，所构建的微生物组不仅能够避免资源竞争或直接干扰导致作用互相抵消，而且能够互相协同互相促进有效抑制黄瓜枯萎病。

技术实现思路

1、本发明提供一种强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组及其制备方法与应用。

2、本发明的的一种强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组，包括的菌株为：

3、1)贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)vjh5041，该菌株已于2024年05月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2024902；

4、2)多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)sxc20-b62，该菌株已于2020年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21540；

5、3)枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)yjzl20-1，该菌株已于2020年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21531。

6、优选的，上述三种菌株在培养基中的接种量均为：4％-12％。

7、优选的，该方法用于对强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组的制备，具体步骤为：

8、s1：从健康黄瓜土壤中筛选对黄瓜枯萎病病原菌有较强抑制作用的生防菌株，生防菌株为三种，分别命名为：vjh5041、sxc20-b62和yjzl20-1，黄瓜枯萎病病原菌选用尖孢镰刀菌黄瓜专化型；

9、s2：分别验证三种生防菌株对黄瓜枯萎病的防病效果；

10、s3：对三种生防菌株的具体种类进行鉴定；

11、s4：对三种生防菌株进行培养，并确定最优培养条件；

12、s5：确定核心微生物组的组成及其配比。

13、优选的，分别验证步骤s3的三种生防菌株对黄瓜枯萎病的防病效果，具体的验证步骤为：

14、1)在健康黄瓜植株根际采集土壤样品，采用五点取样法采集土壤；

15、2)供试的病原菌选为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum，foc)

16、3)选择检测用试剂盒以及生防菌株培养基；

17、4)生防菌株的分离、纯化以及保存；

18、5)生防菌株的筛选，筛选抑菌作用做明显的菌株；

19、6)生防菌株对foc菌丝生长影响检测；

20、7)生防菌株对黄瓜枯萎病的生防及促生效果测定；

21、8)利用试剂盒对生防菌株诱导黄瓜相关防御酶活力进行测定。

22、优选的，步骤s4对三种生防菌株的具体种类进行鉴定的方法为：

23、1)对生防菌株的分子生物学进行鉴定；

24、2)对生防菌株的全基因组进行测定，具体步骤为；生防菌株的基因组dna提取、测序以及组装；生防菌株的平均核苷酸一致性分析；生防菌株的基因组注释分析；

25、3)鉴定后的三种生防菌株具体种类分别为：贝莱斯芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；因此三种生防菌株具体命名为：贝莱斯芽孢杆菌vjh5041、多粘类芽孢杆菌sxc20-b62以及枯草芽孢杆菌yjzl20-1。

26、优选的，步骤s5对三种生防菌株的具体培养步骤为：

27、1)选择供试菌株和供试培养基，供试菌株选择为：贝莱斯芽孢杆菌vjh5041、多粘类芽孢杆菌sxc20-b62以及枯草芽孢杆菌yjzl20-1；

28、2)生防菌株种子液的制备；

29、3)三种生防菌株相容性测定；

30、4)通过正交实验优化三种生防菌株的配比，该过程以核心微生物组的菌体密度od600值和对foc的抑制率作为衡量指标，其中od600值表示菌体密度或菌群密度的指标，通过测量样品在600纳米波长处的光吸收强度来间接反映细菌细胞在液体培养基中的浓度；

31、5)对核心微生物组抑制黄瓜枯萎病的发酵基础培养基进行筛选及优化，具体包括：碳源种类的筛选及其浓度优化、氮源种类的筛选及其浓度优化、无机盐种类的筛选及其浓度优化以及菌株基础培养基优化的正交实验；

32、6)对核心微生物组的培养条件优化，具体包括：核心微生物组培养条件优化的响应面实验以及核心微生物组发酵培养基及培养条件优化前后的对比试验，其中核心微生物组培养条件优化的响应面实验是根据单因素实验筛选出的接种量、培养时间、培养温度、培养转速和初始ph，进行响应面程序进行设计，程序列出的每个培养基组合为1个处理进行菌株发酵培养，每个处理重复3次，测定发酵液的菌体密度od600值，分析后，确定核心微生物组培养的最佳条件。

33、优选的，步骤s5中核心微生物组的培养条件为：培养基的碳源选为葡萄糖，氮源选为酵母浸粉，无机盐选为磷酸氢二钾，溶剂为双蒸水，培养温度为20-35℃、转速为150-200rpm、时间为18h-24h、初始ph为5.0-7.0。

34、优选的，步骤s5中核心微生物组的培养条件优选为：培养基为30g葡萄糖，20g酵母浸粉，1g磷酸氢二钾，1000ml双蒸水，培养温度为30℃、转速为171rpm、时间为21.6h、初始ph为7.0，贝莱斯芽孢杆菌vjh5041、多粘类芽孢杆菌sxc20-b62以及枯草芽孢杆菌yjzl20-1的接种量的分别设置为：4％、4％和4％。

35、一种强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组的应用，将强防治黄瓜枯萎病的核心微生物组应用于对黄瓜枯萎病的防治，并且该核心微生物组也用于对黄瓜幼苗的促生。

36、与现有技术相比本发明的有益效果为：

37、本发明从黄瓜根际土壤中筛选出了三株对黄瓜枯萎病菌具有高拮抗能力的生防菌，即vjh5041、sxc20-b62和yjzl20-1，通过全基因组测序鉴定其分别为贝莱斯芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，并且优化设计了三种生防菌株的培养条件和配比，使其具有优质的培养效果，培养出来的由三种生防菌株构建的核心微生物组对黄瓜枯萎病均具有良好的生防效果，且均能够显著促进黄瓜幼苗生长。