一种超敏快速的核酸检测方法与流程

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种超敏快速的核酸检测方法。

背景技术：

1、核酸检测技术是分子诊断技术的一种，它主要是通过对人体等进行采样，经过一系列严密的检测实验对特异性核酸片段进行检测从而判断是否感染上某种病毒或疾病。目前市面上常用的针对病原微生物的核酸检测技术包括：基于针对特定片段的核酸扩增和探测的技术方法比如pcr、qpcr、dpcr等，以及基于第二代基因测序的方法如ngs，tngs。

2、以病原微生物的检测为例，不论是pcr，qpcr，dpcr还是ngs技术方案，都有需要对待测核酸片段的进行扩增的过程(即pcr)，以满足探测系统的检测灵敏度要求。这个片段扩增的过程增加了样本到答案的时间，对于临床上一些要较快出结果的应用(如脓毒症)，这些技术手段无法满足检测速度需求。同时，不论是基于变温扩增的pcr技术也好，还是基于等温扩增的方法(主流方法包括lamp、rpa、raa、rca、hda、sat、cpa以及near等)，由于扩增过程带来的随机碱基适配错误而产生的检测假阴性(低灵敏度)，是目前这些以扩增技术为基础的检测方法的主要问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种超敏快速的核酸检测方法。本发明通过磁珠对单条核酸oligo片段的特异性捕获，通过具有高灵敏度探测特性的电化学传感器，免核酸扩增，进行单分子oligo片段的超灵敏及超快速的核酸检测，解决目前主流技术在需要扩增和检测时间长的缺点。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了核酸检测方法，包括如下步骤：

4、样品裂解；

5、核酸捕获；

6、载体捕获；

7、核酸检测；

8、所述核酸捕获通过在所述载体表面结合与待测核酸特异性结合的反应物对所述待测核酸进行捕获；

9、所述载体捕获通过在芯片上修饰与所述待测核酸特异性结合的另一反应物对所述载体进行捕获。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述载体的修饰物包括链霉亲和素(streptavidin)、羧基(-cooh)、氨基(-nh2)、羟基(-oh)或nhs磁珠(-nhs)中的一种或多种；所述反应物的修饰物包括生物素(biotin)、氨基(-nh2)、羧基(-cooh)、羟基(-oh)、醛基(-cho)、琥珀酰亚胺(-nhs)或其他反应性的基团中的一种或多种；

11、所述载体的修饰物与所述反应物的修饰物结合。

12、在本发明的一些具体实施方案中，所述载体捕获中所述修饰包括通过所述芯片表面硅烷化处理后，经dna oligo的磷酸团进行结合反应。

13、在本发明的一些具体实施方案中，所述载体包括磁珠、纳米金颗粒或非磁性小球中的一种或多种；

14、作为优选，所述载体为磁珠。

15、不使用磁珠，还是使用比如纳米金颗粒或者非磁性小球，来进行核酸dna的捕获。这些原理上可以达到类似效果，但是没有外加磁场对磁珠的作用下，小球和芯片表面的结合效率很难提升，清洗掉没有核酸的小球也会有技术难度。

16、在本发明的一些具体实施方案中，通过所述芯片底部的第二磁铁的作用，将所述磁珠微粒吸引到所述另一反应物所在区域，进行所述待测核酸与所述另一反应物的杂交反应；结合反应完成后，移开第二磁铁，从芯片的上方移入第一磁铁，只有通过所述待测核酸与所述另一反应物结合的磁珠留在芯片表面，而没有特异性结合的磁珠则向第一磁铁的方向移动，进而远离芯片表面，清洗后，实现所述载体捕获。

17、芯片的结构可以采用微孔阵列的形式，微孔的直径大于磁珠的粒径，但是小于2倍的磁珠粒径，这样芯片在外部磁力的作用下，内部的磁珠交替进出实现芯片捕获磁珠，同时每个微孔最多捕获一个磁珠。

18、在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸检测通过检测电量的变化，实现化学信号到点信号的转化；

19、作为优选，所述载体捕获后，会引起检测点表面电荷量的变化，进而产生电压的变化，通过每个检测点的电信号的有无，实现对所述待测核酸的检测。

20、通过光学成像探测读取每个测试区域有多少磁珠被修饰在芯片表面来，来取代isfet探测。在待测多重目标的数量不是很多的情况下，光学探测的速度和基于电化学的方法比较接近，但是在设备的复杂度上远大于电化学的方法，即仪器的成本和大小更大。而且在待测多重目标的数量很多的情况下，需要进行光学的成像扫描功能，即对每个视野的扫描后的位移切换到下个视野，这所需要的整体检测时间也会增加。

21、不使用floating gate mosfet进行检测，也可以使用电化学探测，比如两个或者三个探测电极的系统。已经有发表的文章(不确定是否有专利)来用该方法来实现抗原抗体捕获标记物的高灵敏探测技术。这些方法对于待测检测点的数量不多的情况下(比如小于100个)是可以通过多通道切换的方式来实现检测。但是对于检测点的数量达到上百万甚至上千万级，需要实现的检测电路的复杂度会极大提高。而基于floating gate mosfet的检测电路已经有业内类似做isfet的测序公司实现，比如ion torrent，dnae，万众一心等。

22、在本发明的一些具体实施方案中，也可以磁珠捕获完待测核酸dna后，在磁珠表面进行待测核酸dna的pcr扩增，后续通过修饰荧光染料的方法来实现光学探测的方法。虽然还是需要进行pcr，但是可能需要的pcr cycle数可以降低，进而降低整体的运行时间。

23、在本发明的一些具体实施方案中，也可以使用磁珠捕获待测核酸dna后，在捕获能和芯片表面碱基互补配对的报告珠，形成哑铃结构，哑铃结构通过磁力、重力、流体阻力等经过分选，筛选出“磁珠—待测核酸dna—报告珠”的结合物，再加入芯片表面，在芯片表面报告珠和芯片特异性结合，然后通过isfet检测或者光学检测获得结果；报告珠和磁珠捕获待测核酸dna的络合物在溶液中液相反应，而且，报告珠表面高密度的探针和芯片表面的特异性结合效率更高，能显著提高捕获效率。报告珠和芯片表面的结合可以通过碱基互补配对的基因杂交，也可以通过抗原抗体等特异性结合的方式；报告珠则使用不含磁珠的微珠，比如说玻璃珠、聚合物珠等，报告珠的粒径和磁珠的粒径一致，或者磁珠粒径大；合适的粒径范围是1～10μm。

24、相比于上述替代方案，也可以使用磁珠捕获待测核酸dna后，再捕获dnadendrimer树形高分子，树形高分子的末端是和待测核酸dna另一端杂交匹配的核酸探针，再与芯片表面的探针杂交偶联；树形高分子末端也可以使用抗原和抗体等其他特异性结合方式和芯片表面结合。

25、待测核酸结合在磁珠及表面的方式，也可以使用肽核酸pna，锁核酸lna，lna和dna组合的方式形成探针，结合在磁珠或芯片表面，再和待测核酸dna结合；

26、可以通过调整磁珠表面结合的特异性引物，比如说抗原抗体、多肽等，特异性的捕获蛋白、病毒、细菌等，实现单分子免疫，单分子病毒/细胞的捕获和检测。

27、在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸捕获中的反应物包括引物、肽核酸pna、锁核酸lna、抗原、抗体或多肽中的一种或多种；

28、所述载体捕获中的所述另一反应物包括引物、肽核酸pna、锁核酸lna、抗原、抗体或多肽中的一种或多种。

29、第二方面，本发明还提供了所述的核酸检测方法中采用的检测试剂盒，包括所述载体、与待测核酸特异性结合的反应物、所述芯片、与所述待测核酸特异性结合的另一反应物。

30、第三方面，本发明还提供了处理器，所述处理器用于运行程序，其中，所述程序运行时执行所述的核酸检测方法。

31、第四方面，本发明还提供了电子设备或装置，所述电子设备包括：存储器和所述的处理器；

32、其中，在所述存储器中存储有一个或多个计算机程序，所述一个或多个计算机程序包括指令；当所述指令被所述处理器执行时，使得所述电子设备执行所述的核酸检测方法；

33、所述装置包括一个或多个部件，所述一个或多个部件实现所述的核酸检测方法。

34、本发明的有益效果包括：

35、1.通过磁珠对待测核酸dna进行捕获(碱基互补)，而不是利用磁珠对核酸dna的吸附作用(静电相互作用)，这两者的原理完全不同。

36、2.通过检测磁珠的存在，而不是检测单链dna，来降低对检测系统的灵敏度要求，而实现实际意义上的超敏探测

37、3.不需要进行pcr对待测核酸dna的放大扩增，降低了整体测试的时间，也节省了成本(一般引物成本很低，而qpcr等应用里面，试剂里面成本比较高的是聚合酶、扩增酶及荧光探针)

38、4.通过对于表面电荷量非常灵敏的检测的floating gate mosfet传感器，来实现对于表面磁珠的有无的精准判定，进而实现有无待测核酸dna的判定。

39、本发明可以实质上通过单个磁珠微粒对核酸信号的放大，达到不用对核酸分子进行pcr扩增，就可以单分子核酸被探测系统灵敏的检测到的目的。同时由于不再需要进行pcr扩增，节省了由于pcr扩增所消耗的整体运行时间，对于核酸快速检测有重大意义。

40、通过芯片的不同区域修饰不同的捕获引物以及不同的磁珠修饰不同的核酸捕获引物，可以实现多重目标标记物的检测。