一种在植物中快速合成肌酸的方法
技术特征：
1.一种在植物中快速合成肌酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种在植物中合成肌酸的方法，其特征在于步骤1)中，选取人甘氨酸脒基转移酶编码基因hsagat和胍基乙酸甲基转移酶编码基因hsgamt的具体方法为：根据人甘氨酸脒基转移酶编码基因(hsagat:nm_001482.3)和胍基乙酸甲基转移酶编码基因(hsgamt:nm_000156.6)的参考序列号在ncbi数据库进行查询，获得两个基因的全长dna序列，对其cds区域序列进行化学合成，hsagat的cds全长为1272bp，hsgamt的cds全长为711bp。
3.如权利要求1所述的一种在植物中合成肌酸的方法，其特征在于步骤2)，具体包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤a)中pcr扩增反应体系为：kodonemix:25μl，forwardprimer:2μl，reverseprimer:2μl，稀释1000倍的合成序列载体质粒：1μl，h2o：to 50μl；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸30s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b)中pcr扩增反应体系为：kodonemix:25μl，forwardprimer:2μl，reverseprimer:2μl，稀释1000倍的peaq空载体质粒：1μl，h2o：to 50μl；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，68℃延伸2min10s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤c)中反应体系为：2×toroivd onestep fusion cloning mix:5μl，基因片段回收产物：50ng，peaq载体片段回收产物：200ng，h2o:to 10μl；所述连接反应程序为：50℃，30min。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤d)中pcr鉴定引物包括peaq载体连接后阳性鉴定引物peaq-2f、hsagat基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsagat-2r和hsgamt基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsgamt-2r，所述peaq-2f、q-hsagat-2r和q-hsgamt-2r的核苷酸序列如引物序列表seq id no.7～9所示。
8.如权利要求1所述的一种在植物中快速合成肌酸的方法，其特征在于步骤3)的具体步骤为：
9.如权利要求8所述的一种在植物中快速合成肌酸的方法，其特征在于步骤a)中，pcr鉴定引物包括peaq载体连接后阳性鉴定引物peaq-2f、hsagat基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsagat-2r和hsgamt基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsgamt-2r，所述peaq-2f、q-hsagat-2r和q-hsgamt-2r的核苷酸序列如seq id no.7～9所示。
10.如权利要求1所述的一种在植物中快速合成肌酸的方法，其特征在于步骤4)具体包括以下步骤：
技术总结
一种在植物中快速合成肌酸的方法，属于基因工程技术领域。该方法包括：选取HsAGAT和HsGAMT两个基因的CDS序列，进行化学合成；构建上述基因的烟草瞬时表达载体，转化大肠杆菌；将正确的pEAQ载体质粒采用瞬时转化法转入农杆菌中，同时向本氏烟草叶片中注射含有两个基因的表达载体的农杆菌菌液；采集注射的烟草叶片，提取肌酸。本发明创造了肌酸生物合成的新途径，使肌酸生产过程避免了各类有机试剂的使用，节约成本、绿色环保，同时整合了肌酸生产和植物产品的生产过程，克服了化学合成肌酸味苦、难以作为食品添加剂的难题，为构建富含肌酸的植物产品奠定技术基础。
技术研发人员：姜丽娜,范鹏祥,王梓骏,吕焘,茶志梅
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10
技术研发人员：姜丽娜,范鹏祥,王梓骏,吕焘,茶志梅
技术所有人：浙江大学
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