一种在植物中快速合成肌酸的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种在植物中快速合成肌酸的方法。

背景技术：

1、肌酸(creatine)是一种天然含氮有机酸，是动物源性的氨基酸代谢产物，化学式c4h9n3o2，学名n-甲基胍基乙酸。在脊椎动物体内肌酸会在肌酸激酶的作用下形成磷酸肌酸，作为高能磷酸盐加速二磷酸腺苷(adp)到三磷酸腺苷(atp)的循环，在骨骼肌和大脑等组织中参与能量代谢，是一种重要的能量缓冲剂。肌酸在人体中具有广泛且关键的功能，在维持神经、肌肉、视网膜、心血管正常功能中具有重要功效，肌酸也是一种很受欢迎的运动营养补剂，能够在增大肌肉力量、提高最大输出功率，提升整体运动能力的同时，显著降低运动中发生肌肉抽筋、中暑、肌肉劳损的风险。

2、在动物的代谢系统中，肌酸生物合成途径如下：甘氨酸和精氨酸通过甘氨酸脒基转移酶(agat)催化形成胍基乙酸，再由胍基乙酸甲基转移酶(gamt)催化胍基乙酸和s-腺苷甲硫氨酸最终形成肌酸，本发明中利用上述两种酶组成植物肌酸生物合成模块。

3、人体内合成的肌酸大约只能满足每日需求的50％，剩余部分需要依靠饮食摄取。肌酸无法天然在植物中合成，且人体内的肌酸会不断随代谢减少，因此素食主义者和长期缺少肉类摄入的人群容易缺乏肌酸，而长期缺乏肌酸对人体稳态和健康有不良影响，甚至可能会导致肌肉或神经疾病。

4、烟草瞬时转化系统是一种常见的分子生物学和生物化学实验体系，通常使用本氏烟草(nicotiana benthamiana)作为材料，通过注射手段使含有目的基因表达载体的农杆菌菌液侵染烟草叶片，注射后一周内即可在烟草叶片中检测出目的基因的表达产物，相比稳定转化具有周期短、成功率高的特点，并且相比传统化学生产技术，烟草瞬时转化系统合成特定产物的产率更高、成本更低、可控性强的优点。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明涉及的目的在于提供一种在植物中合成肌酸的方法，具体通过以下技术方案加以实现：

2、一种在植物中快速合成肌酸的方法，包括以下步骤：

3、1)选取人甘氨酸脒基转移酶编码基因hsagat和胍基乙酸甲基转移酶编码基因hsgamt，对其序列进行化学合成；

4、2)构建本氏烟草的瞬时表达载体，进行测序，得到正确序列的瞬时表达载体质粒peaq-hsagat和peaq-hsgamt；

5、3)将包含正确序列的瞬时表达载体质粒转入根癌农杆菌中，采用瞬时转化法，同时在本氏烟草叶片中注射peaq-hsagat和peaq-hsgamt表达载体；

6、4)采集注射的本氏烟草叶片，提取氨基酸及其衍生物，利用多反应监测模式mrm方法测定本氏烟草叶片中的肌酸和氨基酸的含量变化。

7、所述步骤1具体为：

8、选取人甘氨酸脒基转移酶编码基因hsagat和胍基乙酸甲基转移酶编码基因hsgamt的具体方法为：根据人甘氨酸脒基转移酶编码基因(hsagat:nm_001482.3)和胍基乙酸甲基转移酶编码基因(hsgamt:nm_000156.6)的参考序列号在ncbi数据库进行查询，获得两个基因的全长dna序列，对其cds区域序列进行化学合成，hsagat的cds全长为1272bp，hsgamt的cds全长为711bp。

9、所述步骤2)具体包括以下步骤：

10、a)使用引物hsagat-peaq-f、hsagat-peaq-r和hsgamt-peaq-f、hsgamt-peaq-r，所述hsagat-peaq-f、hsagat-peaq-r和hsgamt-peaq-f、hsgamt-peaq-r的核苷酸序列如引物序列表seq id no.1～4所示，以各自合成序列的质粒为模板分别扩增hsagat和hsgamt基因的cds全长，使用高保真酶kod进行pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到基因片段回收产物；

11、b)本氏烟草瞬时表达peaq载体线性化片段采用反向pcr方法使用高保真酶kod进行pcr扩增，所用引物为peaq-f和peaq-r，所述peaq-f和peaq-r的核苷酸序列如引物序列表seq id no.5～6所示，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到peaq载体线性化片段回收产物；

12、c)利用同源重组的方法，将回收得到的基因片段与线性化载体片段进行连接，得到连接液；

13、d)将连接液转化大肠杆菌dh5α感受态，50mg/l kan抗性lb平皿中培养，挑菌进行pcr鉴定，对pcr阳性的菌落，振荡培养后提取质粒，进行测序，获取正确cds序列连接peaq瞬时过表达载体。

14、进一步，所述步骤2)的步骤a)中pcr扩增反应体系为：kodone mix:25μl，forwardprimer:2μl，reverseprimer:2μl，稀释1000倍的合成序列载体质粒：1μl，h2o：to50μl；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸30s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。

15、进一步，所述步骤2)的步骤b)中pcr扩增反应体系为：kodone mix:25μl，forwardprimer:2μl，reverseprimer:2μl，稀释1000倍的peaq空载体质粒：1μl，h2o：to 50μl；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，68℃延伸2min10s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。

16、进一步，所述步骤2)的步骤c)中反应体系为：2×toroivd one step fusioncloning mix:5μl，基因片段回收产物：50ng，peaq载体线性化片段回收产物：200ng，h2o:to10μl；所述连接反应程序为：50℃，30min。

17、进一步，所述步骤2)的步骤d)中pcr鉴定引物包括peaq载体连接后阳性鉴定引物peaq-2f、hsagat基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsagat-2r和hsgamt基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsgamt-2r，所述peaq-2f、q-hsagat-2r和q-hsgamt-2r的核苷酸序列如seq id no.7～9所示。

18、所述步骤3)的具体步骤为：

19、a)将正确的质粒peaq-hsagat和peaq-hsgamt转化农杆菌gv3101感受态，在50mg/l卡那霉素和25mg/ml利福平的lb固体培养基培养，挑菌进行pcr鉴定；

20、b)将阳性的gv3101农杆菌置于含有相同抗生素成分的lb液体培养基内，在28℃培养至600nm下光密度(od600)为1.0-1.2，按照od值计算各菌液需用体积，进行混匀，使各菌液终od600为0.5，离心后收集农杆菌，农杆菌依次进行洗涤、重悬、离心、收集沉淀重悬，得到接种菌液，将接种菌液装入注射器内，从叶片下表皮注射到烟草叶片内。

21、进一步，所述步骤3)的步骤a)中，pcr鉴定引物包括peaq载体连接后阳性鉴定引物peaq-2f、hsagat基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsagat-2r和hsgamt基因连接peaq载体后阳性鉴定引物q-hsgamt-2r，所述peaq-2f、q-hsagat-2r和q-hsgamt-2r的核苷酸序列如seq id no.7～9所示。

22、所述步骤4)具体包括以下步骤：

23、a)浸染4-5天后，采集被浸染的烟草叶片，液氮冷冻后，磨碎，于-80℃保存，称取100mg研磨后的样品，加入400μl同位素标记的氨基酸提取缓冲液，涡旋10s后；90℃下提取10min；然后将提取液置于冰上冷却5min，4℃下13000g离心10min；将上清液转移至1.5ml离心管中，使用0.45μm亲水性聚四氟乙烯ptfe离心过滤器过滤至进样瓶中，4℃暂时保存；

24、b)使用安捷伦6495三重四级杆液质联用系统6495triple quadrupole ls/mssystem对氨基酸进行分离测定，色谱柱为waters acquity uplc beh amide 1.7μm，2.1×100mm，流动相为溶剂a(10mm乙酸铵和0.2％甲酸水溶液)和溶剂b(乙腈)，流速0.4ml/min，柱温：40℃。洗脱过程：初始条件90％溶剂b保持1min，随后从1-10min降至50％溶剂b，在50％溶剂b保持4min，在14.5min增加到90％溶剂b，然后在90％溶剂b保持至17min；

25、c)利用多反应监测模式方法测定本氏烟草叶片中氨基酸含量的变化，具体为：采用稀释法进行定量，提取氨基酸时使用同位素标记氨基酸提取缓冲液，利用多反应监测mrm获得峰面积，通过ms输注最佳驻留时间，碰撞能量、裂解电压、母离子和子离子；mrm峰面积与每次运行前后测量的已知标准浓度的校准图进行比较，计算肌酸和氨基酸的浓度。

26、本发明通过构建烟草瞬时转化载体、烟草瞬时表达、液相色谱质谱检测等手段验证了肌酸合成模块在植物中表达的可行性，利用烟草瞬时表达编码agat和gamt两种酶的基因，成功在烟草中创建出肌酸的生物合成途径，实现了在植物中进行肌酸合成。本发明创造了肌酸生物合成的新途径，使肌酸生产过程避免了各类有机试剂的使用，节约成本、绿色环保，同时整合了肌酸生产和植物产品的生产过程，克服了化学合成肌酸味苦、难以作为食品添加剂的难题，为构建富含肌酸的植物产品奠定技术基础，也为在植物中合成其他动物源性氨基酸衍生物以及非植物天然代谢途径合成的化合物方面提供技术借鉴。