一种用于快速检测多粘菌素B发酵液的方法与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法。

背景技术：

1、自然界中的微生物不具备“高产、稳定、生存能力强、易繁殖”的特性。而对于发酵产品来说，菌种是决定发酵企业产品价值的关键，企业必须具备良好的菌种资源库，才能有通过改进发酵工艺和设备以提高产品价值的希望。

2、对于菌种选育来说，不仅需要对菌种进行诱变和特定的基因改造，筛选技术同样重要，而目前关于多粘类芽孢杆菌高产菌种的获得方法的相关研究比较少。同时，大部分筛选依然采用传统摇瓶筛选方法，包括培养皿的单菌落分离培养、摇瓶发酵以及依赖于高效液相色谱仪的发酵液含量检测。其存在筛选量小，效率低，设备占有率大，费时费力的问题，并且液相检测成本较高，时间较长，检测样品数量少。因此，研究一种快速高效、准确的快速检测多粘菌素b发酵液的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术的局限，本发明提供了一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法。目的在于提高多粘菌素b发酵液的检测效率。

2、为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌的孔板培养条件：使用48孔板替代摇瓶，单孔培养基装量由摇瓶单瓶50ml装量降低为1-1.2ml。使用无菌牙签轻轻挑取一半成熟单菌落至48孔板，在32℃，180rpm条件下振荡培养56h。

4、本发明提供了一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法，包括以下步骤：

5、(1)称取多粘菌素b标准品，使用超纯水溶解配置成浓度为1000u/ml的抗生素原液，然后再使用超纯水将配置成的多粘菌素b抗生素原液分别稀释至浓度为0、60、70、80、90、100、110、120u/ml的溶液。

6、(2)取大肠杆菌冻存管加入lb培养基，调整菌液吸光值为a600nm＝0.200-0.300。将已经混匀的指示菌大肠杆菌菌液，按照270μl/孔的装量分装到两个96孔板中，分别用于建立标准曲线和发酵液检测。

7、(3)建立标准曲线。取一个加入大肠杆菌菌液的孔板，分别加入30μl不同浓度无菌标准品溶液混合均匀，设孔板一列8孔为平行。同时，空白对照采用空白lb培养基，阳性对照选取不加抗生素的菌悬液，加入无菌超纯水30μl补齐体积。于32℃静置培养4h后，使用酶标仪于a600nm波长下进行吸光度的测定，检测各浓度标准品溶液的吸光值。以吸光值为横坐标x，以溶液浓度为纵坐标y，绘制标准曲线，添加x、y的线性关系，使得相关系数r2≥0.99即可使用。

8、(4)发酵液检测。吸取离心后的孔板发酵液上清液，加入无菌超纯水稀释100倍，依次吸取30μl稀释液加入另一个加入大肠杆菌菌液的孔板中，混合均匀后，于32℃静置培养4h后，使用酶标仪于a600nm波长下进行吸光度的测定。

9、(5)生物活性数据计算。将检测得到的发酵液吸光值数据代入标准曲线方程中，计算得到的溶液浓度乘以稀释倍数等于发酵液生物活性数据，选择生物活性高的菌株进行保存。

10、与现有技术相比，本发明有以下优势：

11、1.本发明采用菌株初筛发酵培养使用48孔孔板，扩大菌株筛选通量，减少培养基用量，单人单次实验筛选通量达288个单菌落。有效解决了工作强度大、挑取样品数量少、筛选可能性低、设备占有率高、液相检测样品量少、耗时长的问题，提高了检测效率。

12、2.本发明利用生物比浊法，根据菌株发酵液对大肠杆菌的抑制程度，可高效快速通过检测板混浊度判定筛选菌株的产目的产物的能力，增加了筛选到优良菌株的可能性。

13、3.本发明筛选工艺操作简单，准确快速，为其他菌株筛选提供了参考。

1.一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法，其特征在于：所述步骤(2)中单孔培养基装量为1-1.2ml，使用无菌牙签挑取一半成熟单菌落至48孔板，在32℃，180rpm条件下振荡培养56h。

3.根据权利要求1所述的一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法，其特征在于，所述步骤(2)中生物比浊法是以大肠杆菌为指示菌。

4.根据权利要求1所述的一种用于快速检测多粘菌素b发酵液的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的快速检测由以下步骤组成：