检测链球菌属病原体的组合物、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及链球菌属病原体的检测，更具体地，涉及化脓链球菌、兽疫链球菌、犬链球菌、牛链球菌的检测。

背景技术：

1、化脓链球菌(streptococcus pyogenes)，亦称a族链球菌(groupastreptococcus,gas)，是链球菌属中的一种，属于致病性链球菌，根据lancefield分类法，链球菌可以根据细胞壁中的糖类抗原分为多个组，化脓链球菌归类于a组，也被称为a组β溶血性链球菌。化脓链球菌广泛存在于自然界、人及动物粪便和健康人鼻咽部，主要通过皮肤和黏膜感染，可引发多种疾病，如猩红热、丹毒、坏死性筋膜炎、中毒性休克及脓毒症等；此外，它也是引起奶牛乳房炎的病原体之一，通常会导致不同类型的乳房炎，包括临床型和隐性乳房炎。

2、犬链球菌属于兰氏g群链球菌，是一种条件致病菌，通常存在于上呼吸道、肠道、下泌尿道和生殖道。除了可以导致犬和猫的败血症、关节炎等疾病，它也能起奶牛的乳房炎。乳房炎是奶牛常见的疾病之一，病原体种类繁多，引起乳房炎的病原微生物可以分为传染性病原体和环境性病原体，其中环境性链球菌就包括了犬链球菌。

3、牛链球菌(streptococcusbovis)是一种革兰阳性菌，瘤胃中常见的一种兼性厌氧菌，属d群链球菌。1945年mcneal和blevins首次报道牛链球菌可引起感染性心内膜炎，且牛链球菌心内膜炎与结肠癌存在相关性；牛链球菌不仅是胃肠道常在菌，也是一种严重的致病菌，可引起败血症和心内膜炎。此外，牛链球菌也是奶牛乳房炎的常见病原之一，可能导致的临床症状包括乳房红肿、热痛、泌乳减少或停止，以及乳汁变性等，对奶牛养殖业造成严重危害。

4、兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)是链球菌属(streptococcus)中的一种，属于兰斯菲尔德c群的β溶血链球菌，是一种重要的动物致病菌，同时也是人畜共患的病原体。对人类而言，感染通常较为严重，它可以引起严重的播散性疾病，包括败血症、化脓性关节炎、脑膜炎和脓肿等；对动物而言，它不仅可以引起猪链球菌病，而且在奶牛乳房炎中也是一种重要的病原体；兽疫链球菌感染奶牛乳房后，可能导致乳腺发炎、乳汁变质、乳量减少，严重时甚至会导致奶牛丧失泌乳能力。

5、奶牛乳房炎是由多种原因引起的奶牛常发疾病，其中由链球菌引起的奶牛乳房炎在临床上占有很大比例，链球菌引起的乳房炎在很多养牛场中普遍存在，其中乳牛的感染率高于其他牛，感染率约为10％～20％。其在发病初期不容易引起人们的注意，往往是在挤奶过程中因奶牛抗拒挤奶才被发现，一般呈急性或慢性经过，主要表现为乳腺炎或乳管炎，触摸乳房组织时会感觉质地松弛而缺乏弹性。剖检可见乳房组织出现浆液性浸润，乳房切面有明显的炎症反应，发炎部位表面隆起，呈现黄白色外观；乳房淋巴结肿胀，切面多汁，并伴有小的出血点；乳池和乳管部位增厚，有脓块；乳腺腺泡间组织水肿。该病不仅对产奶量造成严重影响，也会使乳品质量下降，给养殖者带来较大的经济损失。

6、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且具有良好的灵敏度和特异性，能够检测并区分引起奶牛乳房炎的病原体微生物，以便针对性地为奶牛乳房炎的防治提供策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测链球菌属病原体的组合物，包括：

2、如seq id no:1～3所示的检测化脓链球菌的上游引物、下游引物及探针；

3、如seq id no:4～6所示的检测兽疫链球菌的上游引物、下游引物及探针；

4、如seq id no:7～9所示的检测犬链球菌的上游引物、下游引物及探针；以及

5、如seq id no:10～12所示的检测牛链球菌的上游引物、下游引物及探针。

6、本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现化脓链球菌、兽疫链球菌、犬链球菌、牛链球菌的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/ml，特异性好，检测更为准确，为兽医提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短兽医对奶牛乳房炎诊断的时间，加快对奶牛实施治疗措施。

7、进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

8、在一些具体的实施方案中，针对动物样本添加外源性内标，进一步地，所述内标是人源内标基因。

9、在一个具体的实施方案中，内标是rnase p或者nadph。

10、进一步地，本发明组合物检测不同病原体的探针之间的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

11、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

12、在一些具体的实施方案中，检测化脓链球菌的探针的荧光报告基团为fam；检测兽疫链球菌的探针的荧光报告基团为hex(或vic)；检测犬链球菌的探针的荧光报告基团为rox；检测牛链球菌的探针的荧光报告基团为cy5。

13、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一组或多组。在本发明中，“组”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

14、本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

15、举例来说，可以包括上述4组引物和探针中的任意3组，也可以包括上述4组引物和探针中的任意2组，也可以包括上述4组引物和探针中的任意1组。

16、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

17、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

18、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。

19、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。

20、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

21、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

22、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

23、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测链球菌属病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为牛链球菌、化脓链球菌、兽疫链球菌，或犬链球菌中的一种或多种。

24、第三方面，本发明提供了一种检测链球菌属病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

25、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

26、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水中的至少一种；阳性质控品是牛链球菌、化脓链球菌、兽疫链球菌、犬链球菌的片段质粒或阳性菌株中的至少一种。

27、进一步地，所述试剂盒还包括dntp(u)s、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

28、进一步地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、尿嘧啶糖基化酶(ung)中的至少一种。

29、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂中的至少一种。

30、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(ung)、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

31、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为5u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。

32、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、udg酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。

33、pcr缓冲液的主要成分包括tris-hcl、nacl、nh4cl、tween 20。

34、在一些具体的实施方案中，单个pcr反应管中反应物总体积为20μl～60μl。

35、在一个具体的实施方案中，单个pcr反应管中反应物总体积为25μl。

36、使用上述体积的反应体系，由于体积小，因此可以减少所需试剂的量，从而降低成本；同时，小体积体系可以加快pcr反应过程中温度变化的速率，缩短时间；还可以降低样品间的交叉污染，特别是在进行高灵敏度检测时更为重要；最后，小体积体系可以减少样品的损失，确保有足够的模板进行有效扩增。

37、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。

38、第四方面，提供了一种用于检测链球菌属病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

39、1)提取待测样本的核酸；

40、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光pcr检测；

41、3)获得并分析结果。

42、在本发明中，用于检测的样本可以是血液等，但不限于此。

43、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

44、ung酶反应，温度为50～60℃，时间为1～6min，1次循环；预变性，温度为90～95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为90～95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

45、进一步地，所述检测链球菌属病原体的方法为非诊断目的。

46、在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测链球菌属病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：

47、1)提取待测样本的核酸；

48、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光pcr检测；

49、3)获得并分析结果。

50、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

51、ung酶反应，温度为50～60℃，时间为1～6min，1次循环；预变性，温度为90～95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为90～95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

52、在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患感染的信息。例如，该方法可以检测牧场环境以及饮用水源是否有上述病原体。