羰基还原酶及其突变体基因和应用的制作方法

本发明涉及酶工程，具体涉及一种羰基还原酶及其突变体基因和应用。

背景技术：

1、托伐普坦是第一种也是唯一一种口服竞争性血管加压素v2受体拮抗剂，已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗临床显著的重度低钠血症和等容量性低钠血症。托伐普坦目前以外消旋体的形式上市。然而，有研究学者发现，在哺乳动物中，包含光学活性托伐普坦（s-(-)-托伐普坦或r-(+)-托伐普坦）的可注射制剂具有比外消旋托伐普坦更高的代谢稳定性，用于预防或治疗多囊肾病。还发现肌肉内施用光学活性托伐普坦的水悬浮液产生比外消旋化合物更高的血清浓度。此外，光学活性托伐普坦在体外的吸收率高于外消旋托伐普坦。为了阐明对映纯托伐普坦的作用机制和药理学特征，光学活性异构体的不对称制备变得尤为重要。

2、制备光学活性托伐普坦的传统方法是化学合成方法。此类方法都需要使用手性试剂进行不对称催化反应，这存在一些缺点。手性试剂的合成是复杂的、昂贵的，并且化合物本身是有毒的，这导致工业应用的成本过高，并与环境问题有关。与化学合成相比，生物合成为制备对映纯托伐普坦提供了一种替代方法。matsubar报道了一种通过脂肪酶催化的酯交换对映选择性合成托伐普坦代谢产物的方法。尽管这种方法能够以高对映体过量（99%e.e.）制备目标化合物的两种对映体，但不对称反应体系通常具有不令人满意的产率（70%），这为大规模应用带来了瓶颈。因此，从环境和实践的角度来看，有必要开发一种更有效的生物合成方法来生产对映体纯托伐普坦。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种具有对映选择性、反应条件温和、环境友好的羰基还原酶及其突变体基因和应用。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种羰基还原酶基因，其来源于圆红冬孢酵母菌（ rhodosporidium toruloides），核苷酸序列如seq id no.4所示。

4、一种上述羰基还原酶基因编码的羰基还原酶，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

5、一种编码上述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达的融合蛋白基因，其核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、一种表达载体，其包含上述羰基还原酶基因或上述融合蛋白基因。

7、进一步的，所述表达载体为pet-30a质粒。

8、一种工程菌，其包含上述表达载体。

9、进一步的，所述工程菌为大肠杆菌bl21(de3)。

10、一种上述羰基还原酶基因在催化合成(s)-托伐普坦中的应用。

11、一种羰基还原酶突变体基因，其在上述羰基还原酶基因的224位g突变为c，526位c突变为t，511位c突变为g，其核苷酸序列如seq id no.8所示。

12、一种上述羰基还原酶突变体基因编码的羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如seqid no.7所示。

13、一种上述羰基还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达的突变体融合蛋白基因，其核苷酸序列如seq id no.11所示。

14、一种突变体表达载体，其包含羰基还原酶突变体基因或突变体融合蛋白基因。

15、进一步的，所述表达载体为pet-30a质粒。

16、一种工程菌，包含上述突变体表达载体。

17、进一步的，所述工程菌为大肠杆菌bl21(de3)。

18、一种上述羰基还原酶突变体基因在催化合成(s)-托伐普坦中的应用。

19、本发明的有益效果在于：本发明的羰基还原酶及其突变体具有突出的对映选择性、温和的反应条件和环境友好性，是将前手性酮还原为手性醇的有价值的生物催化剂。此外，本发明在用于辅因子nadph或nadh再生的重组全细胞系统中，利用羰基还原酶和葡萄糖脱氢的共表达提供了不对称还原的高效方法。因此，本发明对挖掘具有催化合成光学纯托伐普坦的羰基还原酶具有重要意义。

1.一种羰基还原酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

2.一种如权利要求1所述的羰基还原酶基因编码的羰基还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.一种编码权利要求2所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达的融合蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.6所示。

4.一种羰基还原酶突变体基因，其特征在于，其在权利要求1所述羰基还原酶基因的224位g突变为c，526位c突变为t，511 位c突变为g。

5.一种如权利要求4所述的羰基还原酶突变体基因编码的羰基还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.7所示。

6.一种编码权利要求5所述羰基还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达的突变体融合蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.11所示。

7.一种表达载体，其特征在于，其包含如下基因的一种：权利要求1所述羰基还原酶基因、权利要求3所述融合蛋白基因、权利要求4所述的羰基还原酶突变体基因、权利要求6所述的突变体融合蛋白基因。

8.一种工程菌，其特征在于，包含如权利要求7所述的表达载体。

9.一种如权利要求1所述的羰基还原酶基因在催化合成(s)-托伐普坦中的应用。

10.一种如权利要求4所述的羰基还原酶突变体基因在催化合成(s)-托伐普坦中的应用。