使用具有模式化接种的双链DNA大小排阻的单克隆聚簇的制作方法

本申请涉及单克隆聚簇的方法。

背景技术：

1、由于非优势模板链与来自该簇的初级模板群体的信号的干扰，多克隆群集受到噪声增加和信号降低的影响。所产生的信号降低和噪声增加最终导致降低的碱基识别特性，即使在应用纯度滤波之后。产生更高比例的单克隆簇的能力受到典型接种方法的泊松性质的阻碍。另外，非优势链在最终读出中丢失，使得测序过程在读出流通池上的可用dna时效率低下。如果以低密度进行接种以提高被占据的单克隆簇的百分比，则总占据百分比降低，从而降低通量。

技术实现思路

1、本文提供的实施例涉及用于通过将双链dna(dsdna)接种到流通池上而扩增靶核酸的方法和组合物。在一些实施例中，流通池包括蛋白质，并且dsdna连接至与蛋白质相互作用的配体。在一些实施例中，流通池包括固定在流通池上的多个草坪(lawn)引物。

2、本文的一些实施例提供了扩增靶核酸的方法，所述方法包括将双链dna(dsdna)接种到流通池上，所述流通池包括含有蛋白质的第一部分和含有固定在流通池上的多个草坪引物的第二部分，其中所述dsdna包括靶核酸序列和互补核酸序列，并且其中所述dsdna与配体连接，所述配体引起配体和蛋白质之间的相互作用；在配体与蛋白质相互作用后，使dsdna变性以除去互补核酸序列；使用所述草坪引物扩增所述靶核酸序列。

3、在一些实施例中，所述多种草坪引物在一端用正电荷加帽。在一些实施例中，正电荷导致dsdna向流通池的含有蛋白质的第一部分扩散。

4、在一些实施例中，该方法进一步包括在配体与蛋白质之间的相互作用之后从草坪引物去除正电荷。

5、在一些实施例中，通过裂解除去正电荷。在一些实施例中，通过熔融去除正电荷。

6、在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素，所述配体是生物素。

7、在一些实施例中，所述草坪引物包括p5草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括p7草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括p5和p7草坪引物。

8、在一些实施例中，所述流通池在其表面上不包括任何孔。在一些实施例中，所述流通池在其表面上包括孔。在一些实施例中，所述孔包括大孔内的小孔。

9、在一些实施例中，将dsdna接种到流通池上抑制了流通池上的其它的接种事件。

10、在一些实施例中，所述流通池的第一部分是圆形的。在一些实施例中，所述流通池的第一部分包括在80nm和100nm之间的直径。在一些实施例中，所述流通池的第一部分是圆形垫。

11、本文的一些实施例提供了将双链dna(dsdna)接种到流通池上的方法，所述方法包括将dsdna接种到流通池上，所述流通池上包括第一部分和第二部分，所述第一部分包括第一生物分子，所述第二部分包括固定在流通池上的多个草坪引物，其中所述dsdna包括靶核酸序列，并且其中所述dsdna与第二生物分子连接，导致所述第二生物分子和所述第一生物分子之间的相互作用。

12、在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过共价相互作用相互作用。在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过非共价相互作用相互作用。在一些实施例中，非共价相互作用包括蛋白质-配体相互作用。在一些实施例中，蛋白质-配体相互作用包括链霉亲和素-生物素相互作用。

13、本文中的一些实施例提供了一种流通池，所述流通池包括表面，所述表面包括第一部分，所述第一部分包括垫，所述垫包括蛋白质；和第二部分，所述第二部分包括p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一种。

14、在一些实施例中，所述第二部分包括p5和p7草坪引物。

15、在一些实施例中，p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一种用正电荷加帽。

16、在一些实施例中，所述表面包括图案化表面。在一些实施例中，所述图案化表面包括至少一个孔。在一些实施例中，所述至少一个孔包括包含在至少一个大孔内的至少一个孔。

17、在一些实施例中，所述图案化表面包括凝胶。在一些实施例中，所述凝胶包括聚(n-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。

18、本文的一些实施例提供了一种流通池，其包括涂覆有引物的表面，所述引物被正电荷加帽；和包含蛋白质的垫，其中所述垫具有比用正电荷加帽的引物更高的对dsdna的结合能。

19、在一些实施例中，正电荷在流通池的表面处产生较低的能态。

20、在一些实施例中，所述蛋白质包括链霉亲和素。

21、在一些实施例中，正电荷是可裂解的，使得它可以从引物中除去。

22、应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其他(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。

1.一种扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种草坪引物的一端被正电荷加帽。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述正电荷导致dsdna向包含所述蛋白质的流通池的第一部分扩散。

4.根据权利要求2所述的方法，还包括在所述配体与所述蛋白质相互作用后，从所述草坪引物除去所述正电荷。

5.根据权利要求4所述的方法，其中通过裂解除去正电荷。

6.根据权利要求4所述的方法，其中通过熔融除去正电荷。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是链霉亲和素，并且其中所述配体是生物素。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p5草坪引物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p7草坪引物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括p5和p7草坪引物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上不包括任何孔。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上包括孔。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述孔包括在大孔内的小孔。

14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述dsdna接种到所述流通池上抑制了流通池上的其它接种事件。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圆形的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分包括在80nm和100nm之间的直径。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圆形垫。

18.一种将双链dna(dsdna)接种到流通池上的方法，所述方法包括：

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通过共价相互作用而相互作用。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通过非共价相互作用而相互作用。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述非共价相互作用包括蛋白质-配体相互作用。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白质-配体相互作用包括链霉亲和素-生物素相互作用。

23.一种流通池，所述流通池包括：

24.根据权利要求23所述的流通池，其中所述第二部分包含p5和p7草坪引物两者。

25.根据权利要求23所述的流通池，其中p5草坪引物和p7草坪引物中的至少一个被正电荷加帽。

26.根据权利要求23所述的流通池，其中所述表面包括图案化表面。

27.根据权利要求26所述的流通池，其中所述图案化表面包括至少一个孔。

28.根据权利要求27所述的流通池，其中所述至少一个孔包括包含在至少一个大孔内的至少一个小孔。

29.根据权利要求26所述的流通池，其中所述图案化表面包括凝胶。

30.根据权利要求29所述的流通池，其中所述凝胶包括聚(n-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。

31.一种流通池，所述流通池包括：

32.根据权利要求31所述的流通池，其中所述正电荷在所述流通池的所述表面处产生较低的能态。

33.根据权利要求31所述的流通池，其中所述蛋白质包括链霉亲和素。

34.根据权利要求31所述的流通池，其中所述正电荷是可裂解的，使得它可以从所述引物中被去除。