预防/治疗铜绿假单胞菌感染的制作方法

本公开内容涉及鉴别和合成新的甲基化的含鼠李糖的聚糖、蛋白质-聚糖缀合物和它们作为抗原和疫苗的用途。还公开了选择性结合所述聚糖和糖缀合物的抗体。公开了这些聚糖、糖缀合物、对应的组合物和抗体在治疗和预防铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)感染的用途。

背景技术：

1、近年来，大型制药公司已经远离抗生素研究，部分原因在于与潜在回报相比，与开发相关的高风险和成本[1]。新抗生素的替代方案是开发疫苗来预防抗生素耐药细菌引起的感染[2]。针对抗生素耐药性铜绿假单胞菌的疫苗尚未上市，尽管一些疫苗正在临床试验中[3-5]。

2、铜绿假单胞菌在其表面上具有广泛的聚糖。因此，已探索了糖缀合物疫苗[5-7]，尽管这些疫苗都没有被批准用于人类用途[5]。

3、除了疫苗方法之外，针对表面碳水化合物靶标的抗体的治疗潜力也是一个考虑因素。这种方法的当前实例包括通过medimmune靶向psl和通过aridis靶向lps o-抗原[8-11]。medimmune的双特异性抗体方法没有超过1期试验[12]；然而，dna编码的mab疗法(dmab)的潜力显示出希望并且可能减轻直接mab疗法的高成本[13]。这些研究表明，针对铜绿假单胞菌的抗体可能具有治疗应用。

技术实现思路

1、本公开内容总体上涉及包含任选地以糖缀合物形式连接至载体蛋白的新的分离的或合成的铜绿假单胞菌聚糖抗原的化合物和组合物和疫苗。另外提供了选择性结合铜绿假单胞菌聚糖或糖缀合物的抗体。还公开了用途和治疗方法，以及在受试者中提高和利用免疫应答的方法。

2、在一个方面，本发明提供了包含式a的低聚糖部分的抗原性化合物：

3、α-rha3ome(-4α-rha3ome)n-式a

4、其中n为1-5，优选2-4，和其中在每个rha3ome糖部分中的2-位独立地被-oac或-oh取代。

5、在一个方面，本发明提供了包含式a1的低聚糖部分的抗原性化合物：

6、α-rha3ome(-4α-rha3ome)n-x式a1

7、其中n为1-5(优选2-4)，和x为-h或-(4α-man3ome)m-连接柄(handle)；和m为0、1或2，优选0或1；其中在每个rha3ome糖部分中的2-位独立地被-oac或-oh取代。

8、在一个方面，本发明提供了抗原性化合物，其中连接柄为-(ch2)znh2或2-甘油醛，其中z为选自由1-5组成的组的整数。在一个方面，当m为0时，连接柄为-(ch2)2nh2、-(ch2)3nh2或-(ch2)3nh2。

9、在一个方面，如果m为1或2，则连接柄为2-甘油醛。

10、在一个方面，本发明提供了抗原性化合物，其选自由以下组成的组：

11、α-d-rha3ome-4-(α-d-rha3ome-4)4-4-α-d-man3ome-2-甘油醛-1d(os2)；

12、3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖(五糖)；

13、3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖(四糖)

14、3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖苷-(1→4)-3-o-甲基-α-d-吡喃鼠李糖(三糖)

15、

16、在一个方面，本发明提供了包含用于连接至载体蛋白的接头(linker)并且具有式a2的抗原性化合物：

17、α-rha3ome(-4α-rha3ome)n-x-接头式a2

18、其中n为1-5，和x为-(4α-man3ome)m-(连接柄)p-；其中m为0、1或2，优选0或1；和p为0或1；和其中在每个rha3ome糖部分中的2-位独立地被-oac或-oh取代

19、在一个方面，本发明提供了抗原性化合物，其包含与载体蛋白缀合的抗原性化合物的缀合物。

20、在一个方面，所述缀合物具有下式

21、α-rha3ome(-4α-rha3ome)n-x-(接头)q-载体蛋白式a3

22、其中，n为1-5(优选2-4)，和x为-(4α-man3ome)m-(连接柄)p-；其中m为0、1或2，优选0或1；和p为0或1；和q为0或1；和其中在每个rha3ome糖部分中的2-位独立地被-oac或-oh取代。

23、在一个方面，本发明的载体蛋白包括crm197、破伤风类毒素(tt)、铜绿假单胞菌蛋白、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、白喉毒素b片段(dtfb)、dtfb c8、白喉类毒素(dt)、tt的c片段、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌lt、大肠杆菌st、或来自铜绿假单胞菌的外毒素。在一个方面，载体蛋白为crm197、tt或铜绿假单胞菌蛋白。

24、在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文中描述的化合物或缀合物；和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一个方面，所述药物组合物为疫苗。

25、在一个方面，本发明提供了在受试者中提高免疫应答的方法，包括对受试者施用：本文中描述的化合物、缀合物或药物组合物。

26、在一个方面，本发明提供了在受试者中预防铜绿假单胞菌感染的方法，该方法包括对受试者施用：本文中描述的化合物、缀合物或药物组合物。

27、在一个方面，本发明提供了化合物、缀合物、疫苗或药物组合物，其用于预防铜绿假单胞菌感染。

28、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其选择性结合至本文中描述的化合物或缀合物、铜绿假单胞菌的lps和或铜绿假单胞菌的细胞，其中任选地，抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。

29、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其选择性结合至分离的氧化的a-带末端表位抗原(os2)，其中任选地，抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。

30、在一个方面，本发明提供了本文中描述的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合或人源化抗体。

31、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含可变重链cdr1、可变重链cdr2和可变重链cdr3，

32、●其中，可变重链cdr1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:1、seqid no:10和seq id no:19；

33、●其中，可变重链cdr2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:2、seqid no:11和seq id no:20；和

34、●其中，可变重链cdr3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:3、seqid no:12和seq id no:21。

35、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含可变轻链cdr1、可变轻链cdr2和可变轻链cdr3，

36、●其中，可变轻链cdr1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:6、seqid no:15和seq id no:24；

37、●其中，可变轻链cdr2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：gts和rvs；和

38、●其中，可变轻链cdr3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:7、seqid no:16和seq id no:25。

39、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的组合，其中该组合选自由以下组成的组：

40、●包含seq id no:4的氨基酸序列的vh和包含seq id no:8的氨基酸序列的vl；

41、●包含seq id no:13的氨基酸序列的vh和包含seq id no:17的氨基酸序列的vl；和

42、●包含seq id no:22的氨基酸序列的vh和包含seq id no:26的氨基酸序列的vl。

43、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其用于治疗铜绿假单胞菌感染。

44、在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其用于诊断铜绿假单胞菌感染。

45、在一个方面，本发明提供了在动物中治疗铜绿假单胞菌细菌感染的方法，包括将本文中描述的抗体或其抗原结合片段施用至动物。

46、在一个方面，本发明提供了在动物中诊断铜绿假单胞菌细菌感染的方法，包括使测试样品与本文中描述的抗体或其抗原结合片段接触，和检测与其的特异性结合。

47、在一个方面，本发明提供了制备式a1的化合物的合成方法，其中m为0，所述方法包括：

48、●将3-o-甲基化的吡喃鼠李糖苷异头脱保护，以形成3-o-甲基化的吡喃鼠李糖；

49、●将3-o-甲基化的吡喃鼠李糖乙酰化，以形成乙酰化的3-o-甲基化的吡喃鼠李糖苷；

50、●将乙酰化的3-o-甲基化的吡喃鼠李糖苷的o-4部分地脱保护，以形成脱保护的乙酰化的3-o-甲基化的吡喃鼠李糖苷；

51、●将o-4脱保护的乙酰化的3-o-甲基化的吡喃鼠李糖苷偶联，以形成乙酰化的3-o-甲基化的低聚糖；

52、●将乙酰化的3-o-甲基化的低聚糖的o-4脱保护，以形成o-4脱保护的乙酰化的3-o-甲基化的低聚糖；和

53、●将部分地脱保护的乙酰化的3-o-甲基化的低聚糖脱乙酰化，以形成式a1的化合物。

54、在一个方面，本发明提供了制备式a1的化合物的合成方法，其中x为连接柄，所述方法包括以下步骤：

55、●将活化的o-3甲基化的吡喃鼠李糖苷中间体在1-o处与包含经保护的胺的连接柄糖基化，其中活化的单吡喃鼠李糖苷中间体包含在糖基化位点4-o处的保护基，并且形成经保护的1-o糖苷中间体；

56、●从4-o除去保护基并且形成脱保护的1-o糖苷中间体；

57、●将脱保护的1-o糖苷中间体偶联至活化的o-3甲基化的吡喃鼠李糖苷中间体，其中活化的吡喃鼠李糖苷中间体包含在4-o处的保护基，并且形成经保护的甲基化的二糖、三糖、四糖或五糖；和

58、●从经保护的低聚糖除去所有保护基，其中低聚糖优选为三糖、四糖或五糖。