一种结合MYO6蛋白的核酸适配体及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种结合myo6蛋白的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、肌球蛋白vi(myosin vi，myo6)是一种在真核细胞中具有独特功能的非传统肌球蛋白分子马达。它与其他肌球蛋白不同，因为它是唯一一个沿着微丝反向运输(从微丝正端向负端运输)的肌球蛋白。myo6在细胞自噬、内吞途径等众多细胞过程中扮演着重要角色，其功能的缺失或异常与多种人类疾病相关，例如肥厚性心肌病、宫颈癌、前列腺癌、耳聋和脑星形胶质细胞增多症等。

2、越来越多的研究发现myo6与肿瘤的发生及侵袭转移相关，并在一些肿瘤组织(如卵巢癌、前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、白血病等)中呈现高表达状态，与此同时，myo6在正常细胞中低表达，这使myo6成为非常有吸引力的靶点蛋白或肿瘤药物开发的重要靶标，实现myo6的定性和定量检测、纯化，并开发用于诊断和治疗myo6表达异常的试剂或药物有着非常重要的意义。

3、核酸适配体(aptamers)是一类能够通过分子识别与特定目标分子(如小分子、蛋白质、核酸、细胞或整个生物体)高特异性结合的单链寡核苷酸。它们通常通过一种称为指数富集的配体筛选过程(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，selex)从随机核苷酸序列库中筛选得到。它具有高特异性和高亲和力，并且它相较于抗体分子量小，稳定性更好，易于合成和修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此它应用非常广泛，包括但不限于药物开发、生物传感、诊断工具和治疗剂等。

4、然目前尚未有能够特异性结合myo6蛋白的核酸适配体的报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种结合myo6蛋白的核酸适配体，其与myo6蛋白的结合亲和力高，特异性好，分子量小，化学性质稳定，易于保存和标记。本发明还提供了所述核酸适配体的缀合物或衍生物、其筛选方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种结合myo6蛋白的核酸适配体，该核酸适配体能够以高亲和力结合myo6蛋白，且具有高特异性，可用于针对myo6蛋白的检测、诊断、成像以及治疗等方面的应用。

4、在本发明的一些实施方式中，所述核酸适配体的序列包括seq id no.1或2所示的核苷酸序列，本文中将其分别命名为gp-1和gp-2，其中，核酸适配体gp-2是从核酸适配体gp-1的核苷酸序列中截短获得的。

5、在本发明的一些优选的实施方式中，所述核酸适配体的序列如seq id no.1或2所示。更优的，所述核酸适配体的序列如seq id no.2所示。本文中通过实验证实了，能够特异性结合myo6蛋白的核酸适配体的关键结构域在gp-2(seq id no.2)中。

6、在本发明的另外的一些实施方式中，所述核酸适配体的序列包括与seq id no.1或2所示的核苷酸序列具有至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列，本文中是指seqid no.1或2所示的核苷酸序列中一个或两个以上核苷酸被置换、缺失或添加而得到的序列，只要其依然具有与myo6蛋白特异性结合的功能，亦属于本发明的保护范围。

7、在本发明的另外的一些实施方式中，所述核酸适配体包括由seq id no.1或2所示的核苷酸序列转录的rna序列。本文中所述的转录包括dna序列中的遗传密码被转录为rna；随后rna可以被翻译为蛋白质。

8、在本发明的另外的一些实施方式中，所述核酸适配体包括能够与seq id no.1或2所示的核苷酸序列进行杂交的序列。一般来说，本文中所述的杂交是指其中两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。

9、在本发明的另一些实施方式中，可选择的，在所述核酸适配体的某一位置或多个位置上进行修饰，本文中所述的“多个”是指两个以上。所述修饰例如可以是磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧、同位素化中的至少一种。只要修饰后的序列依然具有与myo6蛋白特异性结合的功能，例如具有与修饰前母体核苷酸序列相等或更高的与myo6蛋白的亲和力，或者虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性等，亦属于本发明的保护范围。

10、本发明第二方面提供了一种结合myo6蛋白的核酸适配体缀合物或衍生物。

11、本文中所述的缀合物是指有本发明第一方面所述的核酸适配体通过连接标记物形成的，其序列中含有本发明中第一方面中所述的核酸适配体的序列。其中，与所述核酸适配体连接的标记物包括放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记、荧光素标记、核酸探针、纳米发光材料、小肽或sirna中的一种或两种以上。

12、其中，放射性物质主要是指本领域中常见的可用于同位素标记技术的具有放射性的物质，具体可提及的实例包括但不限于2h(氘标d)、13c、14c、15n、17o、18o、34s等。

13、治疗性物质是指用于治疗疾病、缓解症状或改善健康状况的物质，具体可提及的实例包括但不限于化学合成的或生物来源的药物。

14、酶标记是指具有酶活性的标记物，将其与核酸适配体进行结合，能够显著提高核酸适配体在生物检测中的应用效率，例如利用酶催化反应产生可测量的信号，这些信号通常表现为颜色变化、荧光增强或发光现象，便于进行定量分析。通过酶标记能够显著提高检测的灵敏度和特异性。此外，由于酶催化反应能够放大信号，微量的目标分子也能够被准确识别。一般来说应用于核酸适配体上的酶标记具体可提及的实例有辣根过氧化物酶(hrp)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或蛋白酶g(proteinase g)，但并不限于此。

15、荧光素标记是指可发出荧光的标记，具体可提及的实例包括但不限于荧光蛋白(如gfp等)、fam、fitc、罗丹明、得克萨斯红、cy系列染料等。

16、核酸探针例如可以是地高辛。

17、纳米发光材料例如可以是量子点、聚合物纳米颗粒等。

18、在本发明的一些优选的实施方式中，优选的，使用荧光素进行标记。

19、可以理解的是，本文中可被用于连接于核酸适配体的标记物均为本领域中已知的，其连接方式为本领域中熟知的如共价连接、二硫键连接、氨基连接等。这些物质能够在核酸适配体的5’端和3’端中的任意一端或两端连接于核酸适配体，在某些条件下，可以分子间连接。

20、这些缀合物只要具有与myo6蛋白特异性结合的功能，具有与连接前母体核苷酸序列相等或更高的与myo6蛋白的亲和力，或者虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性等，亦属于本发明的保护范围。

21、本文中所述的衍生物是指由本发明第一方面所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物通过改造形成的。

22、在本发明中，所述的改造包括由所述核酸适配体或核酸适配体缀合物的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；或者，由所述核酸适配体或核酸适配体缀合物的核苷酸序列改造成的肽核酸。只要经过改造后的衍生物具有与myo6蛋白特异性结合的功能，亦属于本发明的保护范围。

23、其中，本文中硫代磷酸酯骨架具有本领域人员普遍认知的定义，是指rna和dna核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。本领域技术人员知晓，这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。

24、本文中所述的肽核酸(pna)具有本领域技术人员普遍认知的定义，是指其骨架由通过肽键结合的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元构成的寡核苷酸，其中，不同含氮碱基通过亚甲基键(-ch2-)和羰基(-(c＝o)-)结合于主链。

25、可以理解的是，上文中所述的经过修饰的核酸适配体、核酸适配体缀合物或衍生物，都具有与母体核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，即均可用于与myo6蛋白的特异性结合。

26、本发明第三方面提供了一种筛选结合myo6蛋白的核酸适配体的方法，基于selex技术进行，包括以下步骤：

27、(1)合成随机单链dna文库并提供引物，所述dna文库包括如tccagcactccacgcataac-36n-gttatgcgtgctaccgtgaa所示的随机单链dna，其中，36n表示由36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列；所述引物的序列如sen id no.3～6所示；

28、(2)磁珠法筛选：进行至少4轮的反筛与筛选，并在第4轮开始添加血清；

29、进一步方案，所述步骤(2)所述的在第4轮添加血清，具体过程为：在第4轮添加2％血清，在第5轮添加5％血清；所述血清为人血清。

30、其他步骤等均为本领域中较为熟知的工艺手段，具体的工艺流程条件可参照本领域中熟知的方法或者基于所采用的试剂、试剂盒等的说明书进行操作即可，这里不再一一阐述。

31、本发明第四方面提供了一种检测myo6蛋白的产品，所述产品中含有前文所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物或采用前文所述的方法筛选得到的核酸适配体。

32、本发明第五方面提供了一种纯化myo6蛋白的产品，所述产品中含有前文所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物或采用前文所述的方法筛选得到的核酸适配体。

33、在本发明中所述的产品主要为非疾病诊断或治疗目的的体外产品，例如可以是制剂、试纸条、试剂盒、芯片或层析检测装置，这样的产品中含有前文所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物，从而能够实现与myo6蛋白的特异性结合，以实现检测myo6蛋白或纯化myo6蛋白的目的。

34、可以理解的是，这些产品中根据需要还可以包括myo6蛋白或纯化所需的其他试剂，例如缓冲液、清洗液等，根据需要进行配置即可，这里不再具体阐述。

35、具体检测或纯化时，根据采用的技术不同而有所区别，但核心均是将核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物与myo6蛋白接触来实现检测或纯化的。

36、本发明第六方面提供了一种用于治疗由myo6蛋白表达异常引起的疾病的药物，其含有前文所述的核酸适配体或前文所述的核酸适配体缀合物或衍生物或采用前文所述的方法筛选得到的核酸适配体。

37、该药物中含有前文中所述的核酸适配体或前文所述的核酸适配体缀合物或衍生物，因此，能够靶向myo6蛋白，与myo6蛋白发生特异性结合，从而能够治疗由myo6蛋白表达异常引起的疾病，在本发明中，所述的myo6蛋白表达异常是指细胞或组织中myo蛋白呈高表达；所述的疾病可以是由于myo蛋白呈高表达引起的肿瘤，例如可以是卵巢癌、前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌或白血病，但并不限于此。。

38、可以理解的是，在本发明中，所述药物中还含有药学上任意可接受的辅料和/或载体。

39、在本发明的一些具体的实施案例中，所述的药学上任意可接受的辅料和/或载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂中的至少一种。

40、其中，在本发明的一些具体的实施案例中，对于稀释剂例如可以是乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等，但并不限于此。对于粘合剂例如可以是淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等，但并不限于此。对于表面活性剂例如可以是：聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等，但并不限于此。对于吸附载体例如可以是淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土、皂粘土等。对于润滑剂例如可以是硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等，但并不限于此。对于填充剂例如可以是甘露醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙、碳酸氢钠等，但并不限于此。对于崩解剂例如可以是交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

41、此外，在本发明中，所述的辅料和/或载体还可以是稳定剂、缓冲剂、等渗剂、ph调节剂或螯合剂中的至少一种。

42、具体辅料和/或载体的选择可以根据所述药物的剂型进行，具体选择时，以能够与所述活性物质相适应，或者能够有效提高药物中所含活性成分的稳定性和溶解性，或者能够改变所述活性物质的释放速率和吸收速率，进而保证或增强活性成分的给药效果。在本发明中，所述药物的剂型没有特别的限定，可以采用本领域中已知的任意有利于给药的剂型，例如可以是：水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂等。本文中所述的有利于给药是指能够提高治疗效果或者提高生物利用度或者降低毒副作用或者提高患者的适应性等。

43、本发明第七方面提供了前文所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物或采用前文所述的方法筛选得到的核酸适配体在制备检测或纯化myo6蛋白的产品中的应用。所述的产品具有与前文中所述相同的含义，这里不再一一阐述。

44、本发明第八方面提供了如前文所述的核酸适配体或核酸适配体缀合物或衍生物或采用前文所述的方法筛选得到的核酸适配体在制备用于治疗由myo6蛋白表达异常引起的疾病的药物中的应用。这里所述的药物具有与前文中所述相同的含义，这里不再一一阐述。

45、本发明的有益效果：

46、本发明提供的核酸适配体能够特异性结合myo6蛋白，具有亲和力高、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优势。该核酸适配体可用于与myo6蛋白相关的检测、诊断、成像以及治疗等方面，如可用于制备纯化或高灵敏度检测myo6蛋白的产品；或者，可用于制备治疗由myo6蛋白表达异常引起的疾病的药物等等，应用前景广阔。