一种动物血源抗氧化肽及其制备方法与应用

本发明涉及抗氧化肽，具体领域为一种动物血源抗氧化肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、ros、rns和其他自由基物质在细胞内过度积累会引起氧化应激，是多种疾病发病和发展的驱动力，包括糖尿病、肥胖症和阿尔茨海默病等慢性疾病。为了防止自由基对人体的损害，学者们开始研究自由基的作用和预防机制，探究自由基与抗氧化作用的关系，并寻找适当的抗氧化剂进行防护。研究表明，源于膳食食物的抗氧化肽有出色的抗氧化潜力，是解决上述慢性疾病发生的最有效策略。

2、畜禽血液富含多种必需氨基酸、蛋白质和矿物质，是一种具有高价值潜力的原料。血液中60％以上的蛋白质存在于血球中，且富含苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等具有直接或间接抗氧化活性的氨基酸残基，是抗氧化肽的良好来源。但关于血球蛋白中抗氧化肽的高效分离提取、结构、活性机制及构效关系等基础研究还相对薄弱，单一分离提取技术效果差，传统的纯化鉴定筛选方法落后、活性物质的功能机制不明等问题严重限制其开发与利用。

3、目前，大多数抗氧化肽分离纯化是通过一系列膜和色谱技术分离和纯化肽，使用质谱法鉴定肽序，最后合成鉴定出的多肽进行功能活性验证。然而，在大多数情况下，分离和纯化后鉴定出的多肽会增加多肽合成和功能活性验证的工作量。因此，需要探索新技术来研究食品衍生肽。

4、抗氧化肽的评价方法常见的有基于化学体系的评价、体外细胞模型评价及体内动物实验评价。一般来说，根据所涉及的化学反应，这些检测方法的目的是相对量化目标底物的氢原子转移、单电子转移或金属离子螯合能力。体外化学试验考虑到某些肽在体外表现出强烈的抗氧化活性，但在体内却无法有效抵御氧化反应的不足，因此其在体内存在不确定性。动物临床试验成本高，周期长。

5、近些年发展起来的计算机模拟法是一种基于生物信息学分析、分子对接、动力学模拟等计算机辅助分析的新技术，可应用于筛选、预测和阐明多肽的潜在活性和机理。分子对接和分子动力学模拟相结合，有利于快速筛选功能活性肽，减少肽合成和验证的工作量，并能从分子相互作用的角度解释蛋白质和生物活性肽之间的结构与活性关系。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种动物血源抗氧化肽及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种动物血源抗氧化肽，其氨基酸序列为glwgkv和livypw中的至少一种，具体如seq id no：1-2所示。

4、本发明所述的动物血源抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)血红蛋白肽粗产物的制备

6、取新鲜抗凝鸡血，离心后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤三次，获得新鲜红细胞；将上述得到的红细胞使用超声波细胞粉碎机破碎红细胞，破碎液离心弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥成血红蛋白粉备用；

7、取血红蛋白粉按照料液比1:11、酶解时间4.75h、碱性蛋白酶酶活力6280u/g进行酶解。酶解结束灭酶离心取上清液；将上清液初始ph调至7.8，添加米曲霉接种量8％，发酵32h。离心取上清液冻干得血红蛋白肽粗产物，极大提高了抗氧化活性，并且在ph、温度、nacl和金属离子等因素的影响下稳定性更高；

8、(2)超滤

9、将上清液置于布氏漏斗中通过双层滤纸进一步过滤，收集过滤液；将过滤液经切向流过滤系统进行超滤；将超滤得到的三个级分(m1＜3kda，3kda＜m2＜10kda，10kda＜m3)滤液冷冻干燥，测量抗氧化活性；

10、(3)凝胶排阻色谱分离

11、将多肽溶液浓度调整为5mg/ml，通过0.22μm聚醚飒滤膜过滤除杂后进样，进样量100μl，缓冲液为0.01m hcl，室温下恒定流速0.35ml/min；选择紫外检测器，在214nm波长处收集信号；使用自动收集器系统收集所有级分，并在-20℃下储存。

12、(4)通过nano-lc-ms/ms检测、生物活性肽的计算机虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟，筛选出glwgkv和livypw两条具有抗氧化活性的多肽。

13、其中，nano-lc-ms/ms检测方法中，流动相a为0.1％甲酸-98％水溶液，其中乙腈为2％；b相为0.1％甲酸-80％乙腈溶液，其中水为20％；流速为300nl/min，梯度洗脱60min；

14、流动相b比例：2～5％持续2min，5～22％持续34min，22～45％持续20min，45～95％持续2min，95％持续2min；

15、质谱条件：ms1，分辨率：120k(@200m/z)，agc：1e6，max it：50ms，扫描范围：一级扫描中强度最高的20个离子经四极杆筛选后使用hcd裂解后进行碎片离子扫描；四极杆隔离窗口为1.2m/z，标准化碰撞能为30％，agc：1e5，max it：100ms。二级扫描分辨率15k；根据色谱峰峰宽，动态排除时间设为30s；单电荷及大于6价的离子不进行二级扫描。

16、生物活性肽的计算机虚拟筛选具体为，toxinpred虚拟预测多肽的毒性，多肽排名器https://distilldeep.ucd.ie/peptideranker/预测多肽的潜在生物活性，预测主要依靠多肽序列中的特定氨基酸残基；多肽的得分从0～1，得分越高，生物活性越高，选择≥0.5的多肽；使用cpppred软件预测肽的潜在生物可及性，该软件根据细胞穿透概率对肽进行排序；多肽的得分从0～1，得分越高生物可穿透性越高；使用biopep-uwmtm生物活性肽数据库进行肽的检索与功能特性的预测。

17、分子对接使用autodock分析所选抗氧化肽与keap1的相互作用；在与抗氧化肽对接之前，首先使用pymol从晶体中去除水分子和原始配体nrf2，然后使用autodock添加氢原子和电荷；将配体绘制为二级结构，然后绘制3d结构并计算最小能量结构；使用autodock进行对接，并使用拉马克遗传算法来寻找配体与受体的最佳结合状态；将遗传算法的数量设置为50，并使用结合能来评估配体与受体的结合能力，能量越低，复合物就越稳定；使用biovia discovery studio 2021client可视化软件获得了多肽和目标蛋白之间相互作用的2d和3d结构。

18、分子动力学模拟是使用gromacs2020软件对通过分子对接获得的蛋白质-配体复合物进行200ns的分子动力学模拟；选择charmm 36作为蛋白质力场，选择gaff2作为配体力场，选择tip3p水模型向蛋白质-配体体系中加入溶剂，建立周期边界为1.0nm的水箱，并加入钠离子和氯离子以平衡体系中的电荷，最大还原真实的实验环境；

19、首先通过约束蛋白质以及小分子的重原子，以及对水分子进行10000步的能量最小化来准备模拟系统；然后，我们释放约束，并对整个系统进行10000步能量最小化；在优化能量后，逐渐将系统加热至300k，在经过1000ps的时间后，系统达到了目标温度；随后，在nvt和npt系统中进行了1ns的平衡操作，以确保系统的稳定性；最后，进行了为期200ns的分子动力学模拟；分析复合物的均方根差(rmsd)、均方根波动(rmsf)、回转半径(rg)和氢键变化并采用了gromacs 2020程序中的g_mmgbsa方法，计算配体与蛋白质的结合自由能。

20、本发明的动物血源抗氧化肽可在食品中，尤其是功能性食品中得到广泛应用。

21、本发明研究将制得的粗肽进一步的纯化鉴定，借助计算机模拟的手段对其理化性质及活性预测，并将分子对接和分子动力学模拟相结合从分子相互作用的角度解释蛋白质和多肽之间的结构-活性关系；实现了有高抗氧化活性的多肽快速筛选，并阐明多肽与keap1蛋白的相互作用及构效关系。

22、目前，细胞试验已成为研究细胞对抗氧化应激的重要工具，作为对体外化学试验的补充。考虑到某些肽在体外表现出强烈的抗氧化活性，但在体内却无法有效抵御氧化反应的不足，细胞实验提供了直接观察细胞内物质同化和代谢过程的窗口。相比于动物实验，细胞实验不仅耗时少，成本也相对较低。本发明采用了h2o2诱导的caco-2细胞氧化损伤模型，从细胞水平探明多肽对氧化损伤的预防作用；研究了多肽对氧化应激损伤细胞中抗氧化酶活性与mda含量的影响，通过western blot验证氧化应激相关通路关键蛋白表达，揭示抗氧化肽预防细胞氧化应激损伤的潜在抗氧化途径，验证了抗氧化肽与keap1蛋白的相互作用机制，以更好地探索结构与活性关系。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

24、(1)本发明制备方法利用益生菌协同酶解技术制备了血红蛋白肽粗肽，与单一酶解技术制备血红蛋白肽相比，羟基自由基清除率、dpph自由基清除率、金属螯合率、还原力分别提升了60.86％、102.97％、78.22％、46.43％，极大提高了抗氧化活性，并且在ph、温度、nacl和金属离子等因素的影响下稳定性更高。

25、(2)本发明研究发现了具有抗氧化活性的多肽glwgkv的其抗氧化机制。

26、(3)本发明将多肽进一步的纯化鉴定，借助计算机的手段对其理化性质及活性预测，实现了抗氧化肽的快速筛选及活性预测；通过分子对接和分子动力学模拟相结合从分子相互作用的角度解释keap1蛋白和多肽glwgkv、livypw之间的结构-活性关系；探明了结合位点，gt占据了keap1-kelch区域氨基酸残基与nrf2形成氢键的6个结合位点，lt占据了keap1-kelch区域氨基酸残基与nrf2形成氢键的2个结合位点。分子动力学模拟结果显示，keap1-glwgkv和keap1-livypw两个复合物在100ns左右均达到了动态平衡，均未脱离蛋白口袋并能够与蛋白牢牢结合。此外，glwgkv与keap1蛋白之间的氢键数量明显多于livypw与keap1之间，glwgkv与keap1蛋白的结合自由能为-86.37kj/mol显著低于livypw与keap1蛋白的结合能-28.403kj/mol，表明了复合物keap1-glwgkv比keap1-livypw更稳定。本发明借助计算机模拟技术结合细胞实验验证，避免传统方法复杂的工艺流程及昂贵的成本，精准、快速、高效、绿色地制备抗氧化肽，并从分子与细胞水平探明血球蛋白中多肽的抗氧化活性机制与构效关系，其方法也可拓展到抗氧化以外的功能活性的快速筛选、预测、验证。

27、(4)本发明发现了多肽glwgkv在模拟胃肠道消化过程中是稳定的，抗氧化活性整体增强。构建了h2o2诱导caco-2细胞氧化损伤模型，从细胞水平探明glwgkv对细胞氧化损伤的预防机制。发现glwgkv提高了h2o2诱导的氧化损伤caco-2细胞中sod、cat和gsh-px的活性，降低了mda含量，增强了nrf2、ho-1和nqo1等蛋白的表达。揭示了glwgkv预防细胞氧化应激损伤的潜在抗氧化途径为：keap1-nrf2-are。

28、(5)本发明的动物血源抗氧化肽可在食品中，尤其是功能性食品中得到广泛应用，有助于提高动物血液综合利用率和经济附加值，还有助于更深入地了解血球源多肽在预防和治疗亚健康方面的潜力，并为副产物高值化功能性食品开发提供理论与技术依据，推动大健康食品产业发展。