一种用于模拟肿瘤细胞穿透脉管壁的实验耗材及其使用方法

本发明涉及细胞实验耗材，具体涉及一种用于模拟肿瘤细胞穿透脉管壁的实验耗材及其使用方法。

背景技术：

1、多数研究者选择通过动物实验观察肿瘤的淋巴管和血管转移能力来评估肿瘤细胞进入血管和淋巴管的能力，但该实验需要采用预先标记的细胞，构建异种移植瘤，并观察至肿瘤出现转移，最后采用特殊手段检测循环内肿瘤细胞的数目，需耗时2-3月，常作为研究的最后验证阶段。而在为确定具体关键分子的筛选过程中，探索新的体外实验手段和利于批量化处理的相应耗材，不仅是基于动物福利3r原则进行的实验替代，对显著缩短实验时间，有利于进行后期数据分析和处理，降低实验花费也是必须的步骤和手段。此外，选择可靠合理的体外实验耗材可以尽可能的简化实验步骤和环节以避免误差，为实验的可重复性提供了保障。

2、在肿瘤进入血管和淋巴管的过程中，一方面需要水解胞外基质，另一方面也需要具有破坏内皮细胞间紧密连接并穿透细胞间隙所需要的细胞膜、细胞骨架和胞核形变外，因此最基本的穿壁过程模型除了需要体现胞外基质的穿透，至少还应该模拟出对血管内皮/淋巴管内皮细胞的穿透过程。当前常用的体外实验中，细胞小室的迁移实验仅评估细胞穿过小孔的能力，而侵袭实验尽管加入了基质胶以模拟细胞外基质，但二者均无法评估细胞穿透紧密连接的单层内皮细胞的过程。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：在评估肿瘤细胞通过血管及淋巴管能力的实验方法中，动物实验耗时长、花费高更多用于肯定实验结果的验证，而现有常规的体外侵袭实验仅模拟肿瘤细胞穿透基质和小孔的过程，难以体现细胞穿透血管/淋巴管内皮的过程，因此无法满足实验的目的和需求。

4、虽然常规的迁移实验和侵袭实验无需考虑如何铺设内皮细胞，并将内皮细胞固定于肿瘤向高血清培养环境运动的路径上，因此这两类实验所需的小室内部容积达到300ul即可进行实验。但其底部直径不足0.7cm，细胞悬液即使涂布在底面上也无法保障生长，因此无法在小室膜另一侧铺设内皮细胞，也就无法高效完成模拟肿瘤细胞穿越胞外基质-内皮细胞这一过程的体外实验步骤，且可重复性低。

5、且目前并无可直接应用的能反映脉管侵袭能力的相应实验耗材，目前已公开发表的文献尽管有部分提及该实验意图模拟的生理过程，但并未见对该实验操作步骤即实现方法的具体描述，也未见除常规transwell小室以外的耗材，故如何实现在小室背面铺设内皮仍需自行探索。申请号为cn202110526358.8的中国专利公开了一种用于模拟细胞内渗的transwell小室及使用方法，该耗材是通过使用热熔transwell小室并进行两两拼接制成，这个改装过程是人为的，导致实验进程受制于实验者的经验和技能熟练程度，故存在实验耗时、低效且重复性不高的缺点。

6、因此，本技术设计了一种可弥补常规的体外肿瘤细胞迁移、侵袭实验无法完成对于肿瘤细胞进入血管、淋巴管过程的仿真模拟的实验耗材，能够完全模拟血管或淋巴脉管管壁，从而可极大提高效率，且具有极高的重复性。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种用于模拟肿瘤细胞穿透脉管壁的实验耗材及其使用方法，能够配合改良transwell小室进行内皮细胞铺设，以解决现有技术中无法弥补常规的体外肿瘤细胞迁移、侵袭实验的缺点，从而无法完成对于肿瘤细胞进入血管、淋巴管过程的仿真模拟，导致实验耗时、低效且重复性不高的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于模拟肿瘤细胞穿透脉管壁的实验耗材，包括组件a和组件b，所述组件a为一端开口且呈倒置锥台体状的插件主体a和设于插件主体a底部的膜a构成的改良transwell小室，所述插件主体a的内部具有用于实验的腔体；所述组件b由两端开口的插件主体b和将插件主体b的内部腔体分隔成两个完全相同的实验腔室的膜b构成，所述插件主体b的纵切面为两个相对称的梯形，所述膜b的一侧设有预包被，所述插件主体a可拆卸插接于插件主体b的实验腔室内，所述插件主体a与插件主体b的实验腔室相适配。

4、优选地，所述膜a和膜b均为膨体聚四氟乙烯膜，所述膜a结构需经细胞tc培养处理，有利于肿瘤细胞附着生长，所述预包被由多聚赖氨酸制成，从而使膜b有利于内皮细胞附着生长。

5、优选地，所述组件a的高度为13mm，顶部外径为18.6mm，底部外径为6.5mm，所述膜a的孔径为8um。

6、优选地，所述膜b的直径为6.5mm，厚度为50um，孔径为8um，所述膜b与预包被间的距离为20-40um。

7、优选地，所述插件主体a和插件主体b均采用高透明度晶体级聚苯乙烯制成，无需经细胞tc培养处理。

8、优选地，所述组件a和组件b经辐照或环氧乙烷灭菌后分别独立包装，所述组件a和组件b组装后总高度为16mm。

9、本发明还提供了一种用于模拟肿瘤细胞穿透脉管壁的实验耗材的使用方法，包括如下步骤：

10、s1、取出组件b置于常规细胞培养的24孔板中，将无预包被面朝上，滴加基质胶工作液至插件主体b的实验腔室内待其凝固；

11、s2、翻转组件b置于24孔板中，使包被有多聚赖氨酸的一面朝上，在组件b的另一实验腔室内滴加内皮细胞悬液进行培养，培养过夜后弃掉培养基，重新添加含10％胎牛血清的培养基；

12、s3、取出组件a，在改良transwell小室的腔体中预先铺设荧光染料标记的肿瘤细胞，轻轻施压使组件a与组件b的任意一个实验腔室扣紧后继续培养8-24小时；

13、s4、结束实验后，拆开组件a和组件b，使用无菌尖刀片切下组件b的膜b部分，置于载玻片上，采用荧光显微镜下观察并计数肿瘤细胞，或使用荧光显微镜扫描模式直接采集整体图像进行进一步分析。

14、优选地，在步骤s1中，所述常规细胞培养24孔板的底面直径为16mm，孔内高度为18mm；所述基质胶工作液为1：39稀释的基质胶溶液，所述基质胶工作液的添加量为100ul。

15、优选地，在步骤s2中，所述内皮细胞悬液添加量为150-200ul，所述内皮细胞悬液进行培养具体为向24孔板中添加575ul完全培养基，盖上24孔板盖子，置于细胞培养箱中培养过夜；所述完全培养基和含10％胎牛血清的培养基的液面均与组件b中膜b的表面齐平。

16、优选地，在步骤s3中，所述轻轻施压使组件与组件b的任意一个实验腔室扣紧具体是需根据使用者意图模拟的肿瘤细胞进/出脉管的过程来进行选择；选择将组件b中包被有基质胶的一面贴近组件a时，即为模拟肿瘤细胞进入脉管的过程，而选择将铺设有内皮的一面贴近组件a时，即为模拟肿瘤细胞渗出脉管定植靶器官的过程。

17、与现有技术相比述，本发明具有以下有益效果：

18、1、常规细胞培养24孔板的底面直径为16mm，孔内高度为18mm，而本技术中组件a的顶部外径为18.6mm，适配于当前标准规格的通用24孔板(无需经tc处理)，从而使组件a的顶部外径悬挂于24孔壁上，且其底部不接触24孔板的孔底；组件a和组件b组装后总高度为16mm，从而使组件b的底部与24孔板的孔底部留有至少2mm空间，确保实验过程中铺设好细胞和基质胶后组件a和组件b的组合件可充分浸泡于培养基中，而不会随着移动24孔板(如放入细胞培养箱中)的动作使组件a和组件b二者的连接产生位移。

19、2、组件a与组件b通过卡扣可拆卸连接，一方面，二者单独辐照灭菌包装有利于分别进行肿瘤细胞和内皮细胞的培养，该过程无任何操作门槛；另一方面，组件a与组件b通过其材料本身的韧性进行连接，在实验结束后可进行拆卸，此时仅需观察组件b未包被赖氨酸面的肿瘤细胞，即可分析肿瘤细胞穿越基质、内皮细胞的能力，即肿瘤细胞进入血管/淋巴管的能力；而传统采用transwell小室进行实验时需翻转小室，在其底部膜上滴加内皮细胞悬液，细胞悬液无法超过50ul，只能在预实验基础上估测内皮细胞生长融合度，在融合度达85％以上时方可将transwell小室翻转过来，置于24孔板中进行下一步的肿瘤细胞铺设，因此，本发明的实验耗材可极大的缩短实验耗时，提高实验效率。

20、3、通过设计一种有利于能完全模拟血管或淋巴脉管管壁的耗材，可弥补常规的体外肿瘤细胞迁移、侵袭实验无法完成的对于肿瘤细胞进入血管、淋巴管过程的仿真模拟，可极大提高效率和可重复性，是对动物福利3r原则中replacement的直接体现，降低时间和经济成本同时也大幅降低了全面评估肿瘤转移潜能的实验门槛，具有良好的社会经济效益。