一种质粒下游制备的装置及方法与流程

本申请实施例涉及生物制药，特别是涉及一种质粒下游制备的装置及方法。

背景技术：

1、在质粒生产过程中，下游制备的起点步骤为碱裂解，碱裂解是为了裂解大肠杆菌细胞，释放质粒，同时将大部分宿主dna及宿主蛋白清除。碱裂解效果直接关系到下游质粒的最终收率及质量。

2、行业内传统碱裂解过程，裂解液的具体成分如表1所示：

3、 溶液名称 溶液成分 重悬液 50mmtris-hcl，20mmglucose，10mmedta，ph8.0 裂解液 0.2mnaoh，1％sds 中和液 3mkac，30％hac，ph5.5

4、重悬液作用可使离心后的菌体重新悬浮，并分散在溶液中。裂解液用于裂解细菌细胞壁，将质粒释放在液体中。中和液用于中和裂解后溶液，促进质粒复性，并提高溶液电导，促使sds发生析出，包裹细胞碎片和宿主dna,宿主蛋白等杂质。

5、在质粒裂解过程中，菌体附近的ph对裂解效果影响很大，最适宜的ph为12-13，更高的ph易造成质粒开环，宿主dna断裂，影响质粒质量及收率。低于12的ph，细菌裂解不彻底，影响质粒收率。

6、菌体重悬液和裂解液混合示意图如图1，重悬液与裂解液混合时，雷诺数较低，两种液体均为层流状态，有明显的交界面，交界面上的ph较高，若不能快速混合均匀降低ph，容易造成菌体裂解时宿主dna断裂，质粒开环。混合时若剧烈搅拌，较高的剪切力也容易造成宿主dna断裂。快速且低剪切的混合方法是提高质粒质量的关键。

7、目前现有的搅拌式混合方法，混合时间长，重悬液与裂解液交界面积大，局部ph过高的情况无法避免，宿主dna较高，开环比例大于20％。后续层析纯化压力较大，质粒纯化收率为40-50％。

8、现有的管式裂解装置，使用动态或静态混合器混合，混合时间缩短，重悬液与裂解面交接面积缩小，开环比例及宿主dna有所改善，质粒收率有所提高。但仍无法避免裂解时局部ph较高的情况。而且对不同的菌体的质粒需要进行裂解工艺开发，工艺通用性不强。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请实施例提供一种质粒下游制备的装置及方法，可有效提高质粒收率且降低生产成本，提高质量。

2、本申请实施例第一方面提供一种质粒下游制备的装置，包括重悬液泵、碱泵、微流控模块、裂解罐、酸泵、裂解菌液泵、静态混合器；其中，重悬液泵和碱泵分别通过管道与微流控模块连接，微流控模块还通过管道依次连接裂解罐和裂解菌液泵，酸泵和裂解菌液泵分别通过管道与静态混合器连接。

3、本申请实施例第二方面还提供一种质粒下游制备方法，采用上述的质粒下游制备的装置，包括如下步骤：

4、步骤一、将菌体与重悬液混合，搅拌重悬处理，得到菌体重悬液；

5、步骤二、将所述菌体重悬液与裂解液经微流控芯片快速混合；

6、步骤三、在裂解罐内静置裂解，得到菌体碱裂解液；

7、步骤四：待先进入裂解罐内的液体静置时间达到裂解时间时，将所述菌体碱裂解液与中和液混合，得到含絮状固体的中和后裂解液；

8、步骤五：将所述中和后裂解液与碳酸氢铵/碳酸氢钠溶液混合以进行杂质絮凝，然后进行澄清和超滤浓缩处理，最后进行除菌过滤及原液分装。

9、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤一中，所述菌体重悬液的菌体浓度为50～100g/l；或

10、所述菌体质量与重悬液体积的比值为1:(9-20)。

11、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤一中，所述重悬处理的搅拌速度为200-300rpm，重悬时间为120-240min。

12、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤一中，所述重悬液按质量体积百分比浓度计包括如下组分：0.12-0.61％三羟甲基氨基甲烷、0.72-1.08％葡萄糖、0.23-0.35％乙二胺四乙酸。

13、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤二中，所述菌体重悬液与裂解液的体积比为1:(1-1.2)；或

14、所述混合方式为微流控模块，裂解方式为在裂解罐内静置；

15、所述静置处理时间为2-30min。

16、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤二中，所述裂解液按质量体积百分比浓度计包括如下组分：0.4-1.2％氢氧化钠、1.8-2.2％十二烷基硫酸钠。

17、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤四中，所述菌体碱裂解液与中和液的体积比为2:(1-1.4)。

18、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤四中，所述中和液按质量体积百分比浓度计包括以下组分：24.54-34.35％乙酸钾、26.25-36.75％乙酸，所述中和液ph为5.0-5.5。

19、在可以包括上述实施例的一些实施例中，步骤五中，所述中和后裂解液与碳酸氢铵溶液的体积比为500:3，所述碳酸氢铵溶液的质量体积浓度为1％；或

20、所述中和后裂解液与碳酸氢钠溶液的体积比为500:3.17，所述碳酸氢钠溶液的质量体积浓度为1％。

21、本申请实施例与现有技术相比，具有如下有益效果：

22、本申请方法可有效提高大规模质粒裂解过程中操作的便易性，裂解后无需层析纯化，有效提高碱裂解效率至80-90％，质粒中宿主dna含量减少；且便于工艺批量化应用、可控性好，采用自动化设备实现，重复性好。

1.一种质粒下游制备的装置，其特征在于，包括重悬液泵、碱泵、微流控模块、裂解罐、酸泵、裂解菌液泵、静态混合器；其中，重悬液泵和碱泵分别通过管道与微流控模块连接，微流控模块还通过管道依次连接裂解罐和裂解菌液泵，酸泵和裂解菌液泵分别通过管道与静态混合器连接。

2.一种质粒下游制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的质粒下游制备的装置，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤一中，所述菌体重悬液的菌体浓度为50～100g/l；或

4.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤一中，所述重悬处理的搅拌速度为200-300rpm，重悬时间为120-240min。

5.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤一中，所述重悬液按质量体积百分比浓度计包括如下组分：0.12-0.61％三羟甲基氨基甲烷、0.72-1.08％葡萄糖、0.23-0.35％乙二胺四乙酸。

6.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤二中，所述菌体重悬液与裂解液的体积比为1:(1-1.2)；或

7.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤二中，所述裂解液按质量体积百分比浓度计包括如下组分：0.4-1.2％氢氧化钠、1.8-2.2％十二烷基硫酸钠。

8.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤四中，所述菌体碱裂解液与中和液的体积比为2:(1-1.4)。

9.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤四中，所述中和液按质量体积百分比浓度计包括以下组分：24.54-34.35％乙酸钾、26.25-36.75％乙酸，所述中和液ph为5.0-5.5。

10.根据权利要求2所述的质粒下游制备方法，其特征在于，步骤五中，所述中和后裂解液与碳酸氢铵溶液的体积比为500:3，所述碳酸氢铵溶液的质量体积浓度为1％；或