一种长链类胶原蛋白多肽的迭代指数合成方法与流程

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种长链类胶原蛋白多肽的迭代指数合成方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是天然细胞外基质(extracellular matrix,ecm)中最主要的蛋白质，同时它也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占总蛋白质含量的25％～30％。到目前为止，已发现的天然胶原蛋白共有二十九种。经研究发现这些胶原蛋白都含有相似的结构特征，由三条α-多肽链组成的紧密的右手三螺旋结构，其中每一条α多肽均含有一个或多个包含三个氨基酸的重复序列，这三个氨基酸为gly-xaa-yaa(其中xaa和yaa可以是任何氨基酸，但通常是脯氨酸和羟脯氨酸)，这些重复序列形成了胶原的中心三螺旋结构，是胶原稳定的基础。胶原蛋白凭借其优越的机械性能、止血性能、促细胞生长、弱抗原性、生物降解性、胶原自缔合性和其他重要的生物学特性被广泛用于生物医学领域。胶原蛋白的大量使用导致了其需求量的日益攀升，目前主流的胶原蛋白提取制备方法包括动物源提取法和基因重组法。动物源性胶原蛋白主要从牛腱、猪皮等动物组织中提取，此长链类胶原水溶性极差且存在免疫原性反应、批次间的不稳定性以及潜在的病原体传播等风险。而对于重组胶原蛋白，根据不同的技术路径可分为重组人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白和重组长链类胶原蛋白这三类。但是重组胶原蛋白也面临样品稳定性不佳、潜在的内毒素释放风险和提纯工艺复杂困难等问题。

2、类胶原蛋白多肽(collagen-like peptide，clp)是化学方法合成得到的合成短肽，其特征是含有(pog)n的重复序列。clp具有与天然胶原蛋白相同的三重螺旋构象，因此被广泛用作研究天然胶原三螺旋稳定性的模型肽，指导更高阶结构的自组装。之前的研究已经证明了clp在改善细胞黏附、增殖和ecm生成方面的潜力，并将其用作组织工程和靶向药物递送的热响应性生物偶联物([1]luo j,tong yw.self-assembly of collagen-mimetic peptide amphiphiles into biofunctional nanofiber[j].acs nano,2011,5(10):7739-47.[2]mo x,zhao s,zhao j,et al.targeting collagen damage forsustained in situ antimicrobial activities[j].journal of controlled release:official journal of the controlled release society,2023,360:122-32)。目前的研究通过考察clp水凝胶的理化性质，如力学强度、屈光度、透明度、含水量、粘度、膨胀系数等，建立水凝胶性能与多肽分子结构之间的关系，不断优化clp的分子设计，高通量筛选出与天然ecm成分、结构和性能相似的仿生clp，用作新型仿生材料。

3、然而，目前还难以制备得到结构准确的长链类胶原蛋白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备结构准确的长链类胶原蛋白多肽的迭代指数合成方法。

2、本发明提供了一种制备长链类胶原蛋白多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(i)制备保护基保护的三肽；

4、(ii)以保护基保护的三肽为原料，利用迭代指数合成法，制备得到长链类胶原蛋白多肽；

5、所述保护基保护的三肽的结构为所述长链类胶原蛋白多肽的结构为r1为羟基保护基团，r2为羧基保护基团，r3为氨基保护基团，n为2的x次方，x为大于等于1的整数。

6、进一步地，步骤(i)制备保护基保护的三肽的方法包括以下步骤：

7、(1)将保护基保护的羟脯氨酸、偶联剂和碱性催化剂溶于有机溶剂，再加入保护基保护的甘氨酸进行缩合反应，然后加入保护剂、咪唑类化合物、催化剂进行上保护反应，纯化后得到保护基保护的二肽产物：r4为氨基保护基团；

8、(2)将保护基保护的二肽产物、脱保护剂溶于有机溶剂中进行脱保护反应，纯化后得到脱保护基的二肽产物：

9、(3)将保护基保护的脯氨酸、缩合剂溶于有机溶剂中，加入脱保护基的二肽产物，在碱性催化剂下反应，纯化后得到保护基保护的类胶原蛋白三肽。

10、进一步地，所述羟基保护基团为乙酰基、叔丁氧羰基、叔丁基二苯基甲硅烷基或甲氧基甲基，所述羧基保护基团为苄基、乙酰基、叔丁氧羰基、叔丁基二苯基甲硅烷基或甲氧基甲基，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基、乙酰基、叔丁基二苯基甲硅烷基或甲氧基甲基。

11、进一步地，步骤(1)中，所述保护基保护的羟脯氨酸为boc-l-羟脯氨酸，所述偶联剂为苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯；所述碱性催化剂为n,n-二异丙基乙胺，所述保护基保护的甘氨酸为甘氨酸苄酯盐酸盐，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，所述保护基保护的羟脯氨酸：苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯：n,n-二异丙基乙胺：保护基保护的甘氨酸的当量比为1：0.5-1：2-5：1-1.2，所述缩合反应的时间为1-5小时；所述保护剂为乙酸酐，所述咪唑类化合物为咪唑，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，所述乙酸酐：咪唑：4-二甲氨基吡啶的当量比为1：1-3：1-3，所述上保护反应的时间为1-3小时；

12、步骤(2)中，所述脱保护剂为1,4环氧六环或其盐，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述保护基保护的二肽产物与脱保护剂的当量比为1：9-11；所述保护基保护的二肽产物与有机溶剂的质量体积比为1：0.5-2；所述脱保护反应的时间为0.5-2小时；

13、步骤(3)中，所述保护基保护的脯氨酸为boc-l-脯氨酸；所述缩合剂为2-肟氰乙酸乙酯、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n'-二异丙基碳二亚胺中的一种或两种以上的混合物，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述碱性催化剂为三乙胺；所述保护基保护的脯氨酸、脱保护基的二肽产物、缩合剂、碱性催化剂的当量比为1：1-3：2-4：1-2；所述保护基保护的脯氨酸与有机溶剂的质量体积比为1：9-11；所述的反应时间为2-6小时。

14、进一步地，步骤(1)中，所述保护基保护的羟脯氨酸：苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯：n,n-二异丙基乙胺：保护基保护的甘氨酸的当量比为1：0.95：3：1.05，所述缩合反应的时间为4个小时；所述乙酸酐：咪唑：4-二甲氨基吡啶的当量比为1：2：2；所述上保护反应的时间为2小时；

15、步骤(2)中，所述脱保护剂为盐酸1,4环氧六环，所述保护基保护的二肽产物与脱保护剂的当量比为1：10；所述保护基保护的二肽产物与有机溶剂的质量体积比为1：1；所述脱保护反应时间为1小时；

16、步骤(3)中，所述缩合剂为2-肟氰乙酸乙酯和n,n'-二异丙基碳二亚胺，所述保护基保护的脯氨酸、脱保护基的二肽产物、2-肟氰乙酸乙酯、n,n'-二异丙基碳二亚胺、碱性催化剂的当量比为1：2：2：1.1：1.1；所述保护基保护的脯氨酸与有机溶剂的质量体积比为1：10，所述反应的时间为4小时。

17、进一步地，步骤(1)所述纯化的方法为：反应结束后，向反应液中加入水，使用乙酸乙酯正向萃取出产物，后续使用水及饱和食盐水反萃，然后用无水硫酸钠吸水，减压浓缩，即得；

18、步骤(2)所述纯化的方法为：反应结束后，除去溶剂，使用冰乙醚沉淀，即得；

19、步骤(3)所述纯化的方法为：反应结束后，向反应液中加入水，首先使用乙酸乙酯正向萃取出产物，后续使用水及饱和食盐水反萃，然后用无水硫酸钠吸水，减压浓缩，即得。

20、进一步地，步骤(ii)包括以下操作：

21、(a)以保护基保护的三肽为原料，与金属催化剂在有机溶剂中进行脱保护反应，纯化后得到中间产物1：

22、(b)将保护基保护的三肽、脱保护剂溶于有机溶剂中进行脱保护反应，纯化后得到中间产物2：

23、(c)将中间产物1、缩合剂溶于有机溶剂中，加入中间产物2，在碱性催化剂下反应，纯化后得到产物：

24、(d)以为原料，重复步骤(a)-(c)，得到长链类胶原蛋白多肽；重复次数为x-1；

25、优选的，所述n为2、4、8、16、32、64。

26、进一步地，步骤(a)中，所述金属催化剂为碳负载钯；所述保护基保护的三肽与金属催化剂的当量比为1：0.005-0.02；所述有机溶剂为甲醇，所述反应时间为3-8小时；

27、优选的，步骤(a)中，所述保护基保护的三肽与金属催化剂的当量比为1：0.01；所述反应时间为6小时。

28、本发明还提供了一种制备脱保护后的长链类胶原蛋白多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

29、(i)按照上述方法制备得到长链类胶原蛋白多肽：

30、

31、(ii)将长链类胶原蛋白多肽与无机碳酸盐溶于有机溶剂反应，脱去r1；然后在氢气作用下，与金属催化剂反应，脱去r2；最后与脱保护剂反应，脱去r3，纯化后得到脱保护后的长链类胶原蛋白多肽：

32、本发明还提供了一种制备氨基端保护的长链类胶原蛋白多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

33、一、按照上述方法制备得到脱保护后的长链类胶原蛋白多肽；

34、二、将脱保护后的长链类胶原蛋白多肽在有机溶剂中与保护剂反应，得到氨基端保护的长链类胶原蛋白多肽：r5为氨基保护基团，优选为乙酰基。

35、综上，本发明提供了一种制备长链类胶原蛋白多肽的迭代指数合成方法。该方法通过液相多肽迭代指数合成方法，按照特定的序列，将脯氨酸、羟脯氨酸和甘氨酸连接，精确制备三肽；然后利用液相迭代指数合成策略，将三肽连接形成具有不同长度的类胶原蛋白多肽前体；最后脱除类胶原蛋白多肽前体末端和侧链的保护基团，制备长链类胶原蛋白多肽。该方法制备的长链类胶原蛋白多肽具有精确的化学结构和均一链长。本发明采用液相迭代指数合成策略，该方法使得合成过程中多肽的分子量呈现指数级增长，减少了反应步骤，提高了长链类胶原蛋白多肽的合成效率，具备合成规模大、成本低等优势，能够精确制备多种功能化的长链类胶原蛋白多肽。

36、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

37、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。