血清替代物、培养基及其在肿瘤类器官培养中的应用的制作方法

本技术属于生物医药领域，具体地，涉及血清替代物、培养基及其在肿瘤类器官培养中的应用。

背景技术：

1、肿瘤类器官（tumor organoids）是一种体外培养的三维细胞结构，来源于患者的原发性肿瘤组织或转移性肿瘤组织。肿瘤类器官能够模拟原发性肿瘤组织的生长和行为，包括细胞异质性、细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用等特征，提供了更接近真实肿瘤的体外研究平台，可用于研究肿瘤的生物学特性、药物敏感性和个体化治疗等方面。目前肿瘤类器官培养都要添加牛血清，传统的动物血清在生物制剂研发和生产中有许多问题，包括批次间变异性、供应不稳定、成本高昂以及潜在的风险传染病等。

2、血清替代物是指用于取代传统的动物血清，在生物制剂研发和生产过程中起到相似或相同功能的替代品。相比于传统方法，使用血清替代物有很多优势：一是减少动物血清使用，避免了批次差异和潜在的风险；二是提高细胞培养质量，通过提供精确和可控的营养物质和生长因子优化了细胞培养环境；三是促进了生物技术的发展，为生物医药工业提供了新的可能性；四是提升了生产效率和降低成本，简化了生产工艺，降低了生产成本；五是符合环保和可持续发展理念，有助于减少对自然资源的消耗。然而，目前缺乏能够完全满足肿瘤类器官培养需求的血清替代物。

技术实现思路

1、本技术旨在解决现有技术问题的至少之一。为此，本技术提出了一种用于肿瘤类器官培养的血清替代物。

2、具体而言，本技术提供了如下技术方案：

3、在本技术的第一方面，本技术提出了一种血清替代物。根据本技术的实施例，该血清替代物包括：胆固醇、l-抗坏血酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、（±）-α-硫辛酸、超氧化物歧化酶、亚硒酸钠、过氧化氢酶、l-肉碱盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-还原性谷胱甘肽、d-（+）-半乳糖、转铁蛋白、亚麻酸、视黄醇乙酸酯、（±）-α-生育酚乙酸酯、皮质酮、dl-α-生育酚、三碘代甲状腺素钠盐、胰岛素和牛血清白蛋白。在本技术的一些示例中，发明人意外发现在血清替代物常用组分中添加胆固醇、l-抗坏血酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸和（±）-α-硫辛酸能够有效模拟肿瘤类器官生长的营养环境，可代替血清进行肿瘤类器官培养，且获得的类器官增殖、分化结果良好。在部分肿瘤类器官培养中，相比于胎牛血清，采用前述血清替代物培养，类器官生长速率更快。更重要的是，采用前述血清替代物进行肿瘤类器官培养，成本更低，适于产业化应用。

4、根据本技术的实施例，上述血清替代物还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

5、在本技术的一些示例中，前述血清替代物中所包含的胆固醇、l-抗坏血酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、（±）-α-硫辛酸、超氧化物歧化酶、亚硒酸钠、过氧化氢酶、l-肉碱盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-还原性谷胱甘肽、d-（+）-半乳糖、转铁蛋白、亚麻酸、视黄醇乙酸酯、（±）-α-生育酚乙酸酯、皮质酮、dl-α-生育酚、三碘代甲状腺素钠盐、胰岛素和牛血清白蛋白的浓度比为（20-500）：（25-1000）：（10-100）：（10-500）：（0.1-20）：（10-500）：（0.1-10）：（25-1000）：（40-800）：（500-10000）：（10-500）：（200-10000）：（300-8000）：（10-500）：（0.1-50）：（10-500）：（0.1-10）：（10-500）：（0.01-1）：（50-5000）：（10-500）。前述质量比组分的血清替代物可以提高肿瘤类器官的培养效率和稳定性，能够更好的维持细胞异质性和生物功能。与传统动物血清相比，该配比的血清替代物具有更好的稳定性、可重复性和批量生产的优势，并且能够减少使用动物来源血清的伦理和传染风险。

6、在本技术的一些示例中，前述血清替代物包括：20mg/l-500mg/l 胆固醇、25mg/l-1000 mg/l l-抗坏血酸、10mg/l-100mg/l 花生四烯酸、10mg/l-500mg/l肉豆蔻酸、0.1mg/l-20mg/l （±）-α-硫辛酸、10mg/l-500mg/l超氧化物歧化酶、0.1mg/l-10mg/l亚硒酸钠、25mg/l-1000mg/l过氧化氢酶、40mg/l-800mg/l l-肉碱盐酸盐、500mg/l-10000mg/l腐胺二盐酸盐、10mg/l-500mg/l l-还原性谷胱甘肽、200mg/l-10000mg/l d-（+）-半乳糖、300mg/l-8000mg/l 转铁蛋白、10mg/l-500mg/l 亚麻酸、0.1mg/l-50mg/l视黄醇乙酸酯、10mg/l-500mg/l（±）-α-生育酚乙酸酯、0.1mg/l-10mg/l 皮质酮、10mg/l-500mg/l dl-α-生育酚、0.01mg/l-1mg/l 三碘代甲状腺素钠盐、50mg/l-5000mg/l 胰岛素和10g/l-500g/l 牛血清白蛋白。前述浓度的血清替代物组分不仅能够支持肿瘤类器官的生长和增殖，还能够维持其细胞异质性和生物功能。与传统动物血清相比，该浓度范围的血清替代物具有更好的稳定性、可重复性和批量生产的优势，并且能够减少使用动物来源血清的伦理和传染风险。

7、在本技术的一些示例中，前述血清替代物包括：50mg/l-200mg/l 胆固醇、50mg/l-500 mg/l l-抗坏血酸、20mg/l-60mg/l 花生四烯酸、30mg/l-300mg/l肉豆蔻酸、1mg/l-10mg/l （±）-α-硫辛酸、20mg/l-150mg/l超氧化物歧化酶、0.5mg/l-5mg/l亚硒酸钠、50mg/l-500mg/l过氧化氢酶、100mg/l-500mg/l l-肉碱盐酸盐、1000mg/l-5000mg/l腐胺二盐酸盐、20mg/l-200mg/l l-还原性谷胱甘肽、500mg/l-5000mg/l d-（+）-半乳糖、500mg/l-3000mg/l 转铁蛋白、30mg/l-300mg/l 亚麻酸、1mg/l-30mg/l视黄醇乙酸酯、20mg/l-200mg/l（±）-α-生育酚乙酸酯、0.5mg/l-5mg/l 皮质酮、50mg/l-200mg/l dl-α-生育酚、0.05mg/l-0.5mg/l 三碘代甲状腺素钠盐、200mg/l-2000mg/l 胰岛素和50g/l-300g/l 牛血清白蛋白。前述浓度的血清替代物组分不仅能够支持肿瘤类器官的生长和增殖，还能够维持其细胞异质性和生物功能。与传统动物血清相比，该配比的血清替代物具有更好的稳定性、可重复性和批量生产的优势，并且能够减少使用动物来源血清的伦理和传染风险。

8、在本技术的一些示例中，前述血清替代物包括：60mg/l 胆固醇、80 mg/l l-抗坏血酸、30mg/l 花生四烯酸、80mg/l肉豆蔻酸、8mg/l （±）-α-硫辛酸、20mg/l 超氧化物歧化酶、4mg/l亚硒酸钠、300mg/l过氧化氢酶、300mg/l l-肉碱盐酸盐、3000mg/l腐胺二盐酸盐、150mg/l l-还原性谷胱甘肽、2000mg/l d-（+）-半乳糖、2500mg/l 转铁蛋白、40mg/l 亚麻酸、25mg/l视黄醇乙酸酯、30mg/l（±）-α-生育酚乙酸酯、3mg/l 皮质酮、60mg/l dl-α-生育酚、0.06mg/l 三碘代甲状腺素钠盐、300mg/l 胰岛素和80g/l 牛血清白蛋白。经过实验验证，前述浓度组分的血清替代物用于肿瘤类器官培养，类器官增殖、分化结果良好。

9、在本技术的一些示例中，前述血清替代物包括：150mg/l 胆固醇、50 mg/l l-抗坏血酸、30mg/l 花生四烯酸、200mg/l肉豆蔻酸、8mg/l （±）-α-硫辛酸、100mg/l 超氧化物歧化酶、4mg/l亚硒酸钠、300mg/l过氧化氢酶、200mg/l l-肉碱盐酸盐、1000mg/l腐胺二盐酸盐、150mg/l l-还原性谷胱甘肽、3000mg/l d-（+）-半乳糖、2500mg/l 转铁蛋白、40mg/l 亚麻酸、30mg/l视黄醇乙酸酯、40mg/l（±）-α-生育酚乙酸酯、4mg/l 皮质酮、60mg/l dl-α-生育酚、0.06mg/l 三碘代甲状腺素钠盐、1000mg/l 胰岛素和50g/l 牛血清白蛋白。经过实验验证，前述浓度组分的血清替代物用于肿瘤类器官培养，类器官增殖、分化结果良好。

10、在本技术的一些示例中，前述血清替代物包括：150mg/l 胆固醇、80 mg/l l-抗坏血酸、30mg/l 花生四烯酸、200mg/l肉豆蔻酸、8mg/l （±）-α-硫辛酸、20mg/l 超氧化物歧化酶、4mg/l亚硒酸钠、300mg/l过氧化氢酶、300mg/l l-肉碱盐酸盐、1000mg/l腐胺二盐酸盐、150mg/l l-还原性谷胱甘肽、3000mg/l d-（+）-半乳糖、2500mg/l 转铁蛋白、40mg/l 亚麻酸、25mg/l视黄醇乙酸酯、100mg/l（±）-α-生育酚乙酸酯、4mg/l 皮质酮、60mg/l dl-α-生育酚、0.07mg/l 三碘代甲状腺素钠盐、300mg/l 胰岛素和80g/l 牛血清白蛋白。经过实验验证，前述浓度组分的血清替代物用于肿瘤类器官培养，类器官增殖、分化结果良好。

11、在本技术的第二方面，本技术提出了一种培养基。根据本技术的实施例，该培养基包括：上述任一示例的血清替代物。在本技术的一些示例中，前述培养基能够用于高效、稳定培养肿瘤类器官。

12、根据本技术的实施例，上述血清替代物还可以包括下列附加技术特征的至少之一：

13、在本技术的一些示例中，前述培养基进一步包括：辅助因子和基础培养基中的至少之一。添加辅助因子促进细胞增殖和分化，同时维持肿瘤类器官的形态和功能；基础培养基则提供了细胞生长所需的基本营养和环境，如碳源、氮源、无机盐等。

14、在本技术的一些示例中，前述辅助因子包括：igf1、gremlin 1、egf、r-spondinl、a8301、y-27632、sb202190、n2、pge2、hepes、glutamax、青霉素、链霉素和dmem/f12培养液。

15、在本技术的一些示例中，前述辅助因子包括：100ng/ml igf1、200ng/ml gremlin1、50ng/ml egf、1μg/ml r-spondinl、500nm a8301、10μm y-27632、10μm sb202190、1×n2、0.5μm pge2、10mm hepes、2mm glutamax、500u/ml 青霉素和500u/ml 链霉素。基于该浓度的辅助因子能够更好的促进结直肠癌类器官的增殖和分化。

16、在本技术的一些示例中，前述辅助因子包括：bmp2，gremlin1，igf2，ltbp2，egf，hgf，y27632，n2，hepes，glutamax，青霉素，链霉素，dmem/f12培养液。

17、在本技术的一些示例中，前述辅助因子包括：50ng/ml bmp2，50ng/ml gremlin1，50ng/ml igf2，100ng/ml ltbp2，100ng/ml egf，50ng/ml hgf，5μm y27632，1x n2，10mmhepes，2mmglutamax，500u/ml青霉素，500u/ml链霉素，dmem/f12培养液。基于该浓度的辅助因子能够更好的促进头颈鳞癌类器官的增殖和分化。

18、在本技术的一些示例中，前述基础培养基选自advanced dmem/f12。

19、在本技术的第三方面，本技术提出了第二方面所述培养基在制备试剂盒中的用途，该试剂盒用于培养肿瘤类器官。在本技术的一些示例中，该试剂盒可以肿瘤细胞的增殖和/或分化，进一步可以获得肿瘤类器官。获得的肿瘤类器官在形态学、转录特征、分泌功能上可以模拟肿瘤生长的真实情况，以此模型为基础进行科学研究具有较高的可靠性。

20、在本技术的第四方面，本技术提出了一种肿瘤类器官的构建方法。根据本技术的实施例，该方法包括：利用第二方面所述培养基对肿瘤细胞进行培养的步骤。基于本技术实施例的具体方法获得的肿瘤类器官在形态学、转录特征、分泌功能上可以模拟肿瘤生长的真实情况，以此模型为基础进行科学研究具有较高的可靠性。

21、根据本技术的实施例，上述肿瘤类器官的构建方法还可以包括下列附加技术特征的至少之一：

22、在本技术的一些示例中，前述肿瘤细胞包括结直肠癌和人头颈鳞癌细胞的至少之一。经实验验证，基于本技术的血清替代物或培养基能够实现结直肠癌和人头颈鳞癌类器官的构建。

23、在本技术的第五方面，本技术提出了一种肿瘤类器官。根据本技术的实施例，该肿瘤类器官采用第四方面所述方法构建。在本技术的一些示例中，基于上述方法构建获得的肿瘤类器官在形态学、转录特征、分泌功能上可以模拟肿瘤生长的真实情况，以此模型为基础进行科学研究具有较高的可靠性。

24、在本技术的第六方面，本技术提出了一种筛选药物的方法。根据本技术的实施例，该方法包括：将待筛选药物与第五方面所述的肿瘤类器官进行接触；比较接触前后肿瘤类器官的疾病状态，判断待筛选药物是否为目标药物。在本技术的一些示例中，基于前述筛选药物的方法，可以获得有效治疗或缓解肿瘤疾病的药物。

25、根据本技术的实施例，上述筛选药物的方法还可以包括下列附加技术特征至少之一：

26、根据本发明的实施例，接触后肿瘤类器官的疾病状态好转，是待筛选药物为目标药物的指示。在本技术的一些示例中，获得的目标药物可抑制肿瘤增殖，如接触后是的肿瘤细胞基因表达恢复正常水平。

27、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。