靶向SIRPα的抗体及其用途的制作方法

发明领域本技术大体上涉及分离的单克隆抗体，特别是嵌合或全人源单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与sirpα结合，具有高亲和力和功能性。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本技术还提供可以包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本技术sirpα抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

背景技术：

1、免疫检查点是免疫系统的调节器，其中免疫细胞必须通过刺激性和/或抑制性免疫检查点，才能继续进行激活或失能。抑制性的免疫检查点对自身耐受特别重要，可阻止免疫系统攻击正常细胞。它们经常被例如肿瘤细胞操纵，以逃避免疫监视。在过去的几十年中，抑制性免疫检查点阻断已在例如癌症免疫疗法中广泛研究，pd-1和/或ctla-4的抑制剂已临床批准用于治疗多种癌症。

2、信号调节蛋白α(sirp-α，也称为sirpα)是先天免疫细胞的抑制性免疫检查点，主要表达在骨髓细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。其在细胞质结构区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)。cd47(在几乎所有细胞类型上表达的膜蛋白)与sirpα一经结合，itim变得磷酸化并募集抑制性分子例如shp-1和shp-2，对细胞激活发挥抑制作用(veillette a,chen j.(2018)trends immunol.39(3):173-184)。很多肿瘤细胞过表达cd47分子，抑制免疫细胞的吞噬作用。

3、到目前为止，已发现10个人sirpα等位基因，人sirpα亚型1(或v1)、亚型2(或v2)和亚型8(或v8)占人中表达的80％。

4、sirpα具有两个接近的sirp家族成员，表达于巨噬细胞和中性粒细胞的sirpβ，和表达于淋巴细胞和自然杀伤细胞的sirpγ。sirpβ不结合cd47，但是一种刺激性受体，而sirpγ以低亲和力结合cd47，但是一种非信号转导受体(barclay,a.n.and brown,m.h.(2006)nat.rev.immunol.6(6):457–464；takahashi s.(2018)biomedical reports.9(1):3-7)。

5、临床前研究显示，破坏sirpα-cd47相互作用，可例如借助于癌细胞上的促吞噬受体如slamf7和mac-1，促进巨噬细胞对癌细胞的吞噬吸收(chen,j.et al.(2017)544:493–497)。吞噬过程中产生的来自癌细胞的抗原肽，可随后启动适应性免疫反应。目前处于临床试验的大多数sirpα-cd47阻断药物，靶向cd47分子，并且能够诱导fcr介导的吞噬作用，例如重组sirpα-fc融合蛋白，或igg1 cd47抗体。这些药物也可能损害正常的表达cd47的造血细胞和非造血细胞，造成贫血、血小板减少和/或白细胞减少，正如在非人模型中观察到的(veillette a,chen j.(2018)同上)。因此，使用针对sirpα的阻断型抗体，存在一些好处，sirpα的组织学分布更加受限，造成的毒性有限。甚至还发现，sirpα在某些实体瘤包括肾细胞瘤和黑色素瘤中异常表达，sirpα抗体可以直接对这些肿瘤细胞启动fcr介导的吞噬作用(yanagita,t.et al.(2017)jci insight 2(1):e89140)。

6、据报道，kwar23，一种经位于cd47-sirpα界面上的表位结合sirpα的sirpα抗体，在体外单独使用或与西妥昔单抗(cetuximab)联合使用时，以浓度依赖的方式，增强巨噬细胞介导的对结直肠腺癌细胞的吞噬作用。bi 765063(boehringer ingelheim/ose)，一种选择性抑制sirpα并恢复肿瘤相关巨噬细胞以及树突状细胞对肿瘤细胞应答的活性的sirpα抗体，目前正作为单药或与pd-1拮抗剂联合，在1期临床试验中，在晚期实体瘤患者中进行测试。cc-95251(celgene)也单独或联合西妥昔单抗或利妥昔单抗(rituximab)，处于治疗晚期实体癌和血液癌的1期临床试验中(uger r,johnson l.(2020)expert opin biolther.20(1):5-8；zhang w et al.(2020)front immunol.11:18)。

7、研究表明，针对sirpα的阻断型抗体可影响sirp家族其他成员的功能，人类sirpα的多态性可能使抗体在某些受试者中疗效较低(yanagita,t.et al.(2017)同上；barclay,a.n.and van den berg,t.k.(2014)annu.rev.immunol.32:25–50)。因此，总是需要更多具有所需特性的单克隆抗体。

8、本技术中对于任何文件的引用或标识，并不是承认这些文件是本发明的现有技术。

技术实现思路

1、本技术的发明人发现了拮抗型的sirpα抗体或其抗原结合部分，其(a)特异性结合sirpα(例如，人和猴sirpα，包括亚型1(v1)、亚型2(v2)和亚型8(v8))，与现有技术sirpα抗体例如kwar23和bi-765063相比，具有相当的(如果不是更高的话)结合亲和力/活性；(b)与sirpβ交叉反应，与现有技术sirpα抗体例如kwar23和bi-765063相比，具有相当的(如果不是更高的话)结合亲和力/活性；(c)不结合sirpγ；(d)不结合小鼠sirpα；(e)阻断sirpα结合cd47，与现有技术抗体相比，具有相当的(如果不是更高的话)阻断活性；(f)能被表达sirpα的细胞内化；(g)诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，与现有技术sirpα抗体例如kwar23和bi-765063相比，具有相当的(如果不是更高的话)活性；和/或(h)显示出体内抗肿瘤活性。

2、本技术的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括体外对人或猴sirpα蛋白的检测以及癌症(包括实体癌和血液癌)的治疗。

3、因此，一方面，本技术涉及结合sirpα的分离的单克隆抗体(例如，嵌合或全人源抗体)或其抗原结合部分，其包含(i)重链可变区，其可以包含vh cdr1区、vh cdr2区和vhcdr3区，其中该vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos:1、2(x1＝n、x2＝g；x1＝n、x2＝a；x1＝a、x2＝g)和3；(2)seq id nos:9(x＝y)、10(x1＝n、x2＝g；x1＝n、x2＝a；x1＝a、x2＝g)和11；或(3)seq id nos:9(x＝f)、10(x1＝n、x2＝g)和11具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，其可以包含vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中该vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos:4、5(x＝n；x＝a)和6；或(2)seq id nos:12、13和14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

4、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含具有vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区的重链可变区，和具有vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区的轻链可变区，其中vh cdr1、vh cdr2、vh cdr3、vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3可以分别包含与(1)seq idnos:1、2(x1＝n、x2＝g)、3、4、5(x＝n)和6；(2)seq id nos:1、2(x1＝n、x2＝a；或x1＝a、x2＝g)、3、4、5(x＝a)和6；(3)seq id nos:9(x＝y)、10(x1＝n、x2＝g；x1＝n、x2＝a；x1＝a、x2＝g)、11、12、13和14；或(4)seq id nos:9(x＝f)、10(x1＝n、x2＝g)、11、12、13和14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区，其可以包含与seq id nos:7(x1＝n、x2＝g；x1＝n、x2＝a；x1＝a、x2＝g)、15(x1＝n、x2＝g；x1＝n、x2＝a；x1＝a、x2＝g)或17具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

6、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含轻链可变区，其可以包含与seq id nos:8(x＝n；x＝a)、16(x＝n；x＝s)或18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

7、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)seq id nos:7(x1＝n、x2＝g)和8(x＝n)；(2)seq id nos:7(x1＝n、x2＝a)和8(x＝a)；(3)seq id nos:7(x1＝a、x2＝g)和8(x＝a)；(4)seq id nos:15(x1＝n、x2＝g)和16(x＝n)；(5)seq id nos:15(x1＝n、x2＝a)和16(x＝s)；(6)seq id nos:15(x1＝a、x2＝g)和16(x＝s)；或(7)seq id nos:17和18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

8、本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含通过二硫键连接的重链和轻链，该重链可以包含重链可变区和重链恒定区，该轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的c端与重链恒定区的n端相连，轻链可变区的c端与轻链恒定区的n端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述的氨基酸序列，该抗体或其抗原结合部分与sirpα结合。

9、重链恒定区可以是具有fcr结合亲和力的重链恒定区，例如基因改造的人igg4恒定区，或人igg1恒定区。重链恒定区可以改造为具有增强的fcr结合亲和力和/或增强的抗体结构稳定性。在一些实施方式中，重链恒定区可以是具有例如seq id no:19所示氨基酸序列的人igg4恒定区，或其功能片段。在一些实施方式中，重链恒定区可以是具有例如seqid no:38(x1＝m、x2＝s、x3＝t；x1＝y、x2＝t、x3＝e)所示氨基酸序列的人igg1恒定区。重链恒定区也可以是具有弱或无fcr结合亲和力的重链恒定区，例如igg4恒定区，或改造的igg1恒定区。轻链恒定区可以是具有例如seq id no.:20所示氨基酸序列的人κ恒定区。

10、在一些实施方式中，本技术的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或者由两条重链和两条轻链组成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或cdr序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或cdr序列，其中抗体与sirpα结合。在其他实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以是单链可变片段(scfv)抗体、或抗体片段例如fab或f(ab’)2片段。

11、本技术还提供双特异性分子，其可以包含本技术抗体或其抗原结合部分，连接于具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如cd19、cd20、cd22、cd4、cd24、cd38、cd123、cd228、cd138、bcma、gpc3、cea、叶酸受体(frα)、间皮素、cd276、gp100、5t4、gd2、egfr、muc-1、psma、epcam、mcsp、sm5-1、mica、micb、ulbp和her-2)的第二功能片段。本技术还提供免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分，连接于治疗剂例如细胞毒素，例如，名为dt3c且具有seq id no:36氨基酸序列的重组蛋白。在另一方面，本技术的抗体或其抗原结合部分可以作为嵌合抗原受体(car)的一部分。还提供可以包含该抗原嵌合受体的免疫细胞，其例如t细胞和nk细胞。本技术的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒一起使用。

12、本技术还提供编码本技术抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及可包含该核酸分子的表达载体、和可包含该表达载体或在其基因组中整合有将核酸分子的宿主细胞。还提供采用该宿主细胞制备本技术的sirpα抗体或其抗原结合部分的方法，其可以包括(i)在该宿主细胞中表达抗体、以及(ii)从该宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体的步骤。

13、还提供一种组合物，例如药物组合物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分、或免疫偶联物、双特异性分子、含car的免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及可选地药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含用于治疗癌症的治疗剂，例如抗癌剂。在一些实施方式中，组合物还包含claudin18.2抗体或cd20抗体。

14、在另一方面，本技术提供一种在有需求的受试者中治疗癌症的方法，其可以包括向受试者施用治疗有效量的本技术组合物。癌症可以是实体癌或血液癌，包括，但不限于，非小细胞肺癌、乳癌、卵巢癌、肾细胞癌、结直肠癌和胰腺癌。组合物可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、免疫偶联物、带car的免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞。如果组合物包含具有强fcr结合亲和力的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、含car的免疫细胞、或溶瘤病毒，优选将组合物局部递送至肿瘤部位。在一些实施方式中，还可以施用至少一种其他的抗癌抗体，例如靶向肿瘤相关抗原例如cd19、cd20、cd22、cd4、cd24、cd38、cd123、cd228、cd138、bcma、gpc3、cea、叶酸受体(frα)、间皮素、cd276、gp100、5t4、gd2、egfr、muc-1、psma、epcam、mcsp、sm5-1、mica、micb、ulbp和her-2的抗体，或靶向抑制性免疫检查点例如lag-3、pd-1、vista或ctla-4的抗体。在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如il-2和/或il-21)或共刺激抗体(例如，cd137和/或gitr抗体)一起施用。在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与化疗剂一起施用，其可以是细胞毒性剂，例如，表阿霉素、奥沙利铂和/或5-氟尿嘧啶(5-fu)。在一些实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以与claudin18.2抗体或cd20抗体一起施用。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如嵌合的或全人源的。在一些实施方式中，受试者是人。

15、在另一方面，本技术提供一种在有需求的受试者中调节或增强免疫应答的方法，包括向受试者施用本技术的组合物，从而受试者的免疫应答得到调节/增强。组合物包含本技术的具有弱fcr结合重链恒定区的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、核酸分子或表达载体。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如嵌合的或全人源的。在一些实施方式中，受试者是人。

16、基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会是明晰的，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本技术中引用的所有文献、genbank条目、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地并入本文。

17、因而，本技术的目标是不在本技术中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本技术并不打算在本技术的范围内包含任何不符合uspto(35u.s.c.§112,第一段)或epo(epc，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合epc第53条(c)和epc细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本技术同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本技术人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。

18、应当注意的是，在本技术中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；且术语例如“基本由…组成”或“基本由…构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如它们允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。