基于超高密度冻存的CHO细胞接种的灌流工艺细胞培养方法与流程

本发明涉及基于超高密度冻存的cho细胞接种的灌流工艺细胞培养方法，属于细胞培养。

背景技术：

1、随着近些年在细胞工程、细胞培养基以及工艺开发方面的显著进展，cho细胞的表达量获得了非常显著的提高。哺乳动物细胞体外培养较之传统的微生物细胞培养难度较大，主要是由于哺乳动物细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对外界环境敏感性强、对营养要求苛刻，且培养过程中细胞状态容易改变。目前常用的哺乳动物细胞培养工艺有：批次培养、补料批次培养和灌流培养。基于哺乳动物细胞灌流培养技术在产物产量、质量及成本等方面表现出来的显著优势，越来越多获批上市的生物药物使用灌流培养工艺进行生产，对灌流培养工艺的开发和优化进而成为当前哺乳动物细胞培养工艺研究的热点。

2、灌流式细胞培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基，绝大部分细胞均保留在反应器内。使用搅拌式生物反应器及细胞截流装置(atf)系统进行细胞培养。细胞的灌流培养一般是将细胞经解冻后，进行种子扩增到一定细胞密度之后，再进行生产培养。例如，现有技术中将相对较低密度冻存细胞(15×106个/ml)经摇瓶规模的复苏、种子扩增至较高密度后再接入灌流罐体进行n-1罐扩种至细胞密度达到40×106个/ml左右时切换灌流培养基进行灌流培养。

3、因而，目前的细胞培养方式存在着以下的问题：

4、(1)种子细胞扩增时间较长，从复苏到扩种至足以接种n-1罐灌流种子扩种阶段的密度需要至少半个月时间；

5、(2)与细胞代次相关的变化率不可控，传代次数越多使得生产细胞越不稳健；

6、(3)种子细胞在摇瓶规模的开放式无菌操作环节使得污染风险较高；

7、(4)在种子扩增阶段维护细胞需要较多的人力；cgmp生产设施的损耗和人力均较大。

8、因此，亟待开发一种细胞培养的方法，在缩短生产时间的同时，又可保证产品的产量及质量，从而提升生产效率、降低生产成本。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于超高密度冻存的cho细胞接种的灌流工艺细胞培养方法。

3、用于解决问题的方案

4、鉴于上述现有技术中存在的问题，发明人进行了深入的研究，通过将经超高密度冻存的细胞解冻后直接进行n-1罐扩种，扩种后进行n罐灌流培养。从而简化了细胞培养工艺环节，较传统的细胞培养工艺节省了半个月左右的时间，在产量和质量可比的前提下提高了工艺开发效率，降低种子扩种阶段的污染风险，由于细胞传代次数减少使得生产细胞更加稳健，且更加符合精益运营的理念。

5、本发明的技术方案如下所述：

6、[1].一种培养cho细胞的方法，其中，包括如下步骤：

7、(1)将冻存的超高密度cho细胞种子进行解冻；

8、(2)将步骤(1)解冻后的cho细胞种子直接接种于生物反应器罐体中进行种子扩增培养；

9、(3)对步骤(2)扩增培养得到的种子细胞进行灌流培养；

10、其中，所述冻存的超高密度cho细胞种子的细胞密度不低于100×106个/ml，优选为不低于150×106个/ml；

11、优选地，所述种子扩增培养为n-1罐种子扩增培养；

12、优选地，所述罐流培养为n罐灌流培养。

13、[2].根据[1]所述培养cho细胞的方法，其中，所述步骤(2)中，cho细胞在反应体系中的初始细胞密度为不低于8.0×106个/ml，使用的培养基包括种子培养基，优选为cd-cho培养基，更优选为加压cd-cho培养基。

14、[3].根据[2]所述培养cho细胞的方法，其中，所述步骤(2)的种子扩增培养的具体操作包括：将解冻的cho细胞种子直接接种至含有种子培养基的罐体中，以1.0～2.5vvd的灌流速率进行扩种培养，将培养温度控制在36.0～37.0℃，溶氧范围控制在20％～80％，ph值控制在6.65～7.35，搅拌转速为220～400rpm。

15、[4].根据[1]～[3]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，当种子扩增培养至细胞密度不低于40.0×106个/ml时，切换罐流培养基进行灌流培养；优选地，所述灌流培养基为73434培养基。

16、[5].根据[1]～[4]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，所述步骤(3)的灌流培养的具体操作包括：将灌流培养基按1.0～2.5vvd的灌流速率进行灌流，将温度控制在36.0～37.0℃，溶氧范围控制在20％～80％，ph值控制在6.65～7.35，搅拌转速为220～400rpm。

17、[6].根据[1]～[5]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，当将步骤(3)中的细胞从种子扩增培养起6天内培养至细胞密度大于40.0×106个/ml时，降温至32～34℃。

18、[7].根据[1]～[6]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，在所述步骤(3)的灌流培养的过程中，控制反应体系中葡萄糖的浓度不低于2.00g/l，当反应体系中葡萄糖浓度低于2.00g/l时流加葡萄糖，以维持反应体系中葡萄糖浓度不低于2.00g/l，当葡萄糖浓度高于3.00g/l时，逐渐减少葡萄糖的流加量至流加停止；

19、可选地，当葡萄糖浓度低于2.00g/l时，葡萄糖的流加量以1.00g/l/天为单位依次增加至浓度不再低于2.00g/l；

20、可选地，当葡萄糖浓度大于3.00g/l时，葡萄糖的流加量以1.00g/l/天为单位依次降低；

21、可选地，灌流培养总时间为25±5天。

22、[8].根据[1]～[7]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，所述cho细胞为包含编码外源蛋白的cho细胞；优选地，所述cho细胞为cho-k1、cho-s、cho-k1sv、cho-gs或cho-dg44，所述外源蛋白为抗体；更优选地，所述外源蛋白为单克隆抗体或双特异性抗体。

23、[9].根据[1]～[8]任一项所述培养cho细胞的方法，其中，所述冻存的超高密度cho细胞种子的制备方法包括：

24、将cho细胞种子按0.3～0.7×106个/ml的密度接种至含有种子培养基的摇瓶中进行逐级扩增培养；

25、然后接种至细胞生物反应器中扩增至细胞密度达到40×106个/ml后以1.0～2.5vvd进行灌流培养至超高细胞密度；

26、不经浓缩等操作将其直接冻存于含6％～10％细胞冻存保护剂dmso和加压cd cho培养基的100ml冻存袋中。

27、发明的效果

28、由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

29、(1)本发明提供的灌流工艺细胞培养方法，对高密度的cho细胞进行n-1罐扩种培养，可节省种子扩增半个月左右的时间，大大缩短了细胞培养时间，提高了生产效率，并且节省了在种子扩增阶段维护细胞的人力，减少cgmp生产设施的损耗和人力；

30、(2)本发明提供的灌流工艺细胞培养方法，是直接对高密度的cho细胞n-1罐扩种培养，将细胞传代次数减少而减轻了与细胞代次相关的变化率，使得生产细胞更加稳健；

31、(3)本发明提供的灌流工艺细胞培养方法，可以提供较高的细胞密度，反应器中的高密度和较大体积细胞库避免了在摇瓶中的开放式无菌操作环节，降低了污染风险；同时，较高的细胞密度可使得产量随之提升，增加了容积产量；

32、(4)本发明提供的灌流工艺细胞培养方法，可获得与传统种子复苏扩增后再进行相同灌流工艺培养组产量及质量可比的蛋白产物。